人重組白細(xì)胞介素-6對大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)的影響

1、    人重組白細(xì)胞介素-6對大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)的影響        摘要目的觀察重組人白細(xì)胞介素-6(rhIL-6)對體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)的影響。方法取培養(yǎng)3、7、14、21和28天(d)的兩組(對照組和rhIL-6組)培養(yǎng)神經(jīng)元，分別觀察其生長發(fā)育和神經(jīng)元活存數(shù)，并用抗Bcl-2抗血清進(jìn)行免疫組化染色，觀察Bcl-2免疫反應(yīng)(Bcl-2-IR)陽性和陰性神經(jīng)元數(shù)目，計算Bcl-2-IR陽性神經(jīng)元所占百分率，并在像分析儀上對Bcl-2-IR神經(jīng)元作

2、平均光密度的色譜分析。結(jié)果培養(yǎng)3、7、14、21和28 d時，rhIL-6組神經(jīng)元活存數(shù)、Bcl-2-IR陽性神經(jīng)元數(shù)和Bcl-2-IR陽性神經(jīng)元的平均光密度均明顯高于對照組。結(jié)論rhIL-6能增強生長發(fā)育過程中海馬神經(jīng)元Bcl-2的表達(dá)，減少神經(jīng)元的退化死亡，表明rhIL-6對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元具有神經(jīng)營養(yǎng)作用。關(guān)鍵詞重組人白細(xì)胞介素-6Bcl-2海馬神經(jīng)元培養(yǎng)細(xì)胞免疫組化中號Q26Q953Q954.67 Effects of RhIL-6 on Bcl-2 Expression in Rat Hippocampal NeuronsDing AishiWang FuzhuangFu Que

3、nwuZhou ChangmanFan Ming(Department of Neurobiology, Institute of Basic Medical Sciences, Academy Military Medical Sciences, Beijing 100850)ObjectiveTo study the effects of recombinant human interleukin-6(RhIL-6) on Bcl-2 expression in cultured hippocampal neurons. MethodsThe hippocampal neurons wer

4、e immunocytochem stained using the antiserum of Bcl-2 in 3、7、14、21 and 28 day old cell. The number and the mean optical density of Bcl-2-immunoreactive(Bcl-2-IR) neurons were observed. ResultsThe number and the mean optical density of Bcl-2-IR neurons were significantly increased with rhIL-6 in cult

5、ured hippocampal neurons. ConclusionRhIL-6 can increased Bcl-2 expression and decreased death of cultured hippocampal neurons in vitro. It suggested that rhIL-6 may act as a neurotrophic factor in the growth and development of hippocampal neurons. Key wordsrecombinant human interleukin-6; Bcl-2; hip

6、pocampal neurons; cultured cell; immunohistochemical method近年研究表明，多數(shù)細(xì)胞都有程序性死亡(又稱凋亡)的傾向，但在很多情況下，由于各種有利于生存因素的作用，使這種凋亡發(fā)生減少。迄今，在已知可抑制細(xì)胞凋亡的有關(guān)分子中，研究較多的是原癌基因蛋白Bcl-2。Bcl-2不但在淋巴系統(tǒng)表達(dá)，也在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)1。體外培養(yǎng)研究表明，在去除生存因子條件下，Bcl-2過度表達(dá)能延緩神經(jīng)元死亡2，Bcl-2基因移植在鼠神經(jīng)系統(tǒng)過度表達(dá)使運動神經(jīng)元的凋亡明顯延緩3。本實驗觀察了體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元生長發(fā)育過程中Bcl-2的表達(dá)及細(xì)胞因子rhIL-6的

7、影響。1材料和方法1.1海馬神經(jīng)元培養(yǎng)按已有的細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行海馬神經(jīng)元培養(yǎng)4，取新生的Wistar大鼠，在無菌條件下分離出雙側(cè)海馬，用1.25g/L胰蛋白酶消化(37 30min)分散并制成5×105/mL密度的細(xì)胞懸液，接種于涂有小牛皮膠的35mm塑料培養(yǎng)皿中，每皿2mL，置36、含10%CO2的培養(yǎng)箱(美國FORMA)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液由體積分?jǐn)?shù)為94% Eagle MEM、5%馬血清和1% N3組合液組成。于培養(yǎng)第3 d在培養(yǎng)液中分別加入細(xì)胞分裂抑制劑阿糖胞苷3mg/L以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的過度增殖，作用48h后更換新鮮培養(yǎng)液，以后每周換液2次，每次更換半液。自細(xì)胞接種開始rhI

8、L-6組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入500U/mL rhIL-6(本所凌世淦教授提供的基因工程產(chǎn)品，電泳純)，并隨著培養(yǎng)液的更換，即時加入相應(yīng)量的rhIL-6，以維持作用濃度，同時設(shè)相應(yīng)的對照組(不含rhIL-6)作平行觀察。1.2海馬神經(jīng)元生長和活存數(shù)的觀察每天定時用倒置相差顯微鏡觀察兩組培養(yǎng)神經(jīng)元的生長發(fā)育，分別于培養(yǎng)3、7、14、21和28 d時在倒置相差顯微鏡(200×)下隨機觀察并計數(shù)50個相鄰視野的活存神經(jīng)元數(shù)作比較。1.3培養(yǎng)神經(jīng)元的Bcl-2免疫組化觀察分別取培養(yǎng)3、7、14、21和28 d的兩組培養(yǎng)神經(jīng)元，經(jīng)40g/L多聚甲醛固定后，用抗Bcl-2抗血清(美國Santa Cru

9、z公司產(chǎn)品)按1500稀釋，并按ABC法進(jìn)行免疫組化染色，用Ni-DAB-葡萄糖氧化酶系統(tǒng)顯色。同時設(shè)替代對照(用正常羊血清替代第一抗體)，在倒置相差顯微鏡(200×)下分別觀察計數(shù)50個相鄰視野中Bcl-2免疫反應(yīng)(Bcl-2-IR)陽性和陰性神經(jīng)元數(shù)目，計算Bcl-2-IR陽性神經(jīng)元所占百分率。并作顯微照相和在CMIAS真彩色病理像分析儀(北京航天大學(xué)與空軍總醫(yī)院共同研制)上用光密度組件對Bcl-2-IR陽性神經(jīng)元作平均光密度的色譜分析。2結(jié)果2.1rhIL-6對海馬神經(jīng)元生長發(fā)育的影響新生大鼠海馬神經(jīng)元種植后6h，大部分神經(jīng)元貼附在膠原生長面上，貼壁細(xì)胞呈圓形，尚未長出突起。培

10、養(yǎng)10h后，兩組神經(jīng)元均有突起向外生長，但rhIL-6實驗組細(xì)胞貼壁數(shù)和神經(jīng)突起數(shù)均多于對照組。繼續(xù)培養(yǎng)3、7、14、21和28 d時，實驗組神經(jīng)元活存數(shù)明顯高于同時期對照組(表1)。表1rhIL-6對海馬神經(jīng)元活存數(shù)的影響Table 1Effects of rhIL-6 on survival of hippocampal neurons (±s, n=50)Culture(t/d)Control(Number of neurons/fields)RhIL-6(Number of neurons/fields)3*7*14*21*28*P0.01 compared with con

11、trol 2.2rhIL-6對海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)的影響經(jīng)Bcl-2免疫組化顯示，Bcl-2蛋白分布于神經(jīng)元胞體內(nèi)，染色為淺紫色。由(A-H)可見，培養(yǎng)3、7、14和28 d時，rhIL-6組神經(jīng)元Bcl-2免疫反應(yīng)較對照組增強，Bcl-2免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)明顯高于同時期對照組(表2)。從Bcl-2免疫反應(yīng)神經(jīng)元陽性率比較看，在培養(yǎng)3、7、14 d時兩組Bcl-2免疫反應(yīng)神經(jīng)元陽性率無明顯變化，但在培養(yǎng)21和28 d時rhIL-6組Bcl-2免疫反應(yīng)神經(jīng)元陽性率顯著高于對照組(表2)。像分析的結(jié)果表明，在培養(yǎng)3、7、14、21和28 d時，rhIL-6組Bcl-2免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的平均

12、光密度均明顯高于同時期對照組(表2)。表2rhIL-6對海馬神經(jīng)元Bcl-2表達(dá)的影響Table 2Effects of rhIL-6 on Bcl-2 Expression of hippocampal neurons (±s, n=50)Culture(t/d)Control rhIL-6Bcl-2-IRnumber of neurons/fieldsPositiverate(%)Mean opticaldensity of Bcl-2-IR neuronsBcl-2-IRnumber of neurons/fieldsPositiverate(%)Mean opticalden

13、sity of Bcl-2-IR neurons3*7*14*21*28*P0.05 *P0.01 compared with control附A、C、E、G：rhIL-6組海馬神經(jīng)元培養(yǎng)3、7、14和28 d時Bcl-2的表達(dá)；B，D，F(xiàn)，H：對照組海馬神經(jīng)元培養(yǎng)3、7、14和28 d時Bcl-2的表達(dá)FigA，C，E，G：Bcl-2 expression of rat hippocampal neurons of rhIL-6 group were cultured for 3,7,14 and 28 days, respectively；B,D,F,H:Bcl-2 expression

14、of rat hippocampal neurons of control group were cultured for 3,7,14 and 28 days, respectively3討論 近年來的研究認(rèn)為，神經(jīng)元死亡中除細(xì)胞壞死以外，還存在另一種細(xì)胞死亡形式凋亡或程序性死亡(apoptosis or programmed cell death, PCD),即在某些生理或病理性因素誘導(dǎo)下，激活膜信號系統(tǒng)，進(jìn)一步啟動與調(diào)控細(xì)胞凋亡或程序死亡有關(guān)的基因，最終導(dǎo)致細(xì)胞按一定程序控制自我破壞和死亡。哺乳動物神經(jīng)元死亡被認(rèn)為是正常發(fā)育過程中一種普遍現(xiàn)象，由于神經(jīng)元只能生長分化，不能分裂增殖，這一特

15、點決定了保護神經(jīng)元，挽救受損傷神經(jīng)元有著重要意義。目前已知有數(shù)種基因參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中能抑制細(xì)胞凋亡的有Bcl-2基因，人體內(nèi)的長壽細(xì)胞表達(dá)Bcl-2量較高，在大腦內(nèi)的表達(dá)相當(dāng)高5，Bcl-2過量表達(dá)能延長神經(jīng)元生存。Garcia等6將表達(dá)Bcl-2基因的質(zhì)粒顯微注入依賴生長因子的體外培養(yǎng)交感神經(jīng)元，可預(yù)防去除神經(jīng)生長因子誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡。Farlie等7用Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行實驗，在沒有神經(jīng)生長因子存在的情況下，背根節(jié)感覺神經(jīng)元仍能很好存活，在該動物模型上切斷坐骨神經(jīng)引起運動神經(jīng)元凋亡明顯延緩3。本實驗用新生大鼠海馬神經(jīng)元進(jìn)行分散培養(yǎng)，觀察細(xì)胞因子rhIL-6對海馬神經(jīng)元生長發(fā)育和

16、Bcl-2表達(dá)的影響，結(jié)果表明rhIL-6能增強生長發(fā)育過程中海馬神經(jīng)元Bcl-2的表達(dá)，減少神經(jīng)元的退化死亡。目前已知IL-6參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)，它可刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌神經(jīng)生長因子8。本實驗結(jié)果證明，細(xì)胞因子rhIL-6有促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制海馬神經(jīng)元凋亡的作用。其進(jìn)一步的機制尚有待深入研究。國家自然科學(xué)基金(39730190)資助；作者單位：丁愛石王福莊傅群武范明軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)生物室， 北京 100850周長滿解放軍北京高等醫(yī)學(xué)專科學(xué)校參考文獻(xiàn)1Castren E, Ohga Y, Berzaghi MP, et al. Bcl-2 m

17、essenger RNA is localized in neurons of the developing and adult rat brain. Neurosci, 1994, 61(1):165-1772Allsopp TE, Wyatt S, Paterson FH, et al. The protooncogene bcl-2 can selectively rescue neurotrophic factor-dependent neurons from apoptosis. Cell, 1993, 73:295-3073Dubois-Dauphin M, Frankowski

18、H, Tsujimoto Y, et al. Neonatal motoneurons overexpressing the bcl-2 protooncogene in transgenic mice are protected from axotomy-induced cell death. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1994, 91:3309-33134丁愛石，王福莊.新生大鼠海馬神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中的生長特性.細(xì)胞生物學(xué)雜志，1993，15(3)：88-905Merry DE, Veis DJ, Hickey WF, et al. Bcl-2 protein expression is wid