人參皂苷Rg2對Alzheimer病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和老年斑形成的影

1、人參皂苷Rg2對Alzheimer病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和老年斑形成的影                         作者：莊瑩 石博 田歆 崔麗【摘要】 目的 探討人參皂苷Rg2對A2535誘導(dǎo)的阿爾茨海默?。ˋD）大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力及老年斑（SP）形成的影響。方法 大鼠腹腔注射人參皂苷Rg2預(yù)防給藥，大鼠雙側(cè)海馬內(nèi)注射A2535建立AD模型，采用

2、Morris水迷宮和被動回避性跳臺反射實(shí)驗檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；Bielschowsky 銀染色改良法檢測各組大鼠SP的表達(dá)。結(jié)果 模型組和溶媒組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較正常對照組明顯下降，人參皂苷Rg2各劑量預(yù)防給藥組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較模型組有所增強(qiáng)；模型組、溶媒組和低劑量組大鼠大腦皮質(zhì)中有SP形成，呈均勻致密的嗜銀團(tuán)，其余各組均未觀察到SP。結(jié)論 人參皂苷Rg2對AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的保護(hù)作用，并能防止SP的形成。 【關(guān)鍵詞】 人參皂苷；阿爾茨海默??；大鼠文獻(xiàn)報道人參皂苷Rg1能夠有效改善阿爾茨海默?。ˋD）模型的學(xué)習(xí)記憶能力1。人參皂苷Rg2與Rg1同屬于人參皂苷三醇型，分子結(jié)

3、構(gòu)相似。本實(shí)驗的目的在于觀察人參皂苷Rg2對AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和老年斑（SP）形成的影響。1 材料與方法1.1 動物分組35月齡清潔級Wistar大鼠84只，體重（250±10）g，購于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心（SCXK吉20030001），隨機(jī)分為正常對照組、AD模型組、銀杏達(dá)莫組、溶媒組、人參皂苷Rg2低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組12只，雌雄各半。自然條件下飼養(yǎng)，正常飲食。1.2 主要試劑及儀器A2535，sigma公司；人參皂苷Rg2采用1，2丙二醇為溶媒，由吉林大學(xué)藥學(xué)院李平亞教授惠贈；銀杏達(dá)莫注射液，貴州益佰制藥；大鼠腦立體定位儀，日本NARISHIGE

4、公司產(chǎn)品；Morris水迷宮，成都泰盟機(jī)械設(shè)備廠制造；大鼠被動回避性跳臺反射實(shí)驗系統(tǒng)，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所產(chǎn)品；AX70 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡，日本制造。1.3 方法1.3.1 預(yù)防給藥各組均采用腹腔注射方式進(jìn)行預(yù)防給藥。正常對照組和AD模型組給予生理鹽水2 ml·kg-1·d-1；銀杏達(dá)莫組給予銀杏達(dá)莫注射液，3.6 mg·kg-1·d-1；溶媒組給予1，2丙二醇，1 ml·kg-1·d-1，人參皂苷Rg2低、中、高劑量組給予人參皂苷Rg2 3、6、12 mg·kg-1·d-1，連續(xù)給藥4 w。1.3.2

5、 建立AD模型預(yù)防給藥第15天時，采用海馬內(nèi)注射A2535方法建立AD模型。A2535用生理鹽水稀釋成濃度為2 g/l的溶液，37孵育1 w，形成聚合狀態(tài)的A2535。各實(shí)驗組大鼠經(jīng)6%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后，備皮，固定于大鼠腦立體定位儀上，常規(guī)消毒皮膚，沿顱頂中線剪開皮膚，暴露頭骨及前囟。參照文獻(xiàn)2，選定注射位點(diǎn)為前囟后3.5 mm，中線旁2.0 mm處。用牙科鉆鉆開顱骨，微量加樣器吸取A2535溶液4 l，垂直進(jìn)針，達(dá)蛛網(wǎng)膜下3.0 mm處，緩慢注射，5 min內(nèi)完成，留針5 min后取出。采用相同方法進(jìn)行對側(cè)海馬內(nèi)等劑量藥物注射。AD模型組、銀杏達(dá)莫組、溶媒組及人參皂苷Rg2

6、各劑量組大鼠海馬內(nèi)均注射A2535，正常對照組大鼠海馬內(nèi)注射等體積生理鹽水。清潔創(chuàng)面后縫合皮下組織和皮膚，對合好切口，強(qiáng)力碘消毒，待大鼠清醒后放回籠中常規(guī)飼養(yǎng)。1.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗各實(shí)驗組建立AD模型2 w后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗，其間繼續(xù)腹腔給藥。Morris水迷宮系統(tǒng)的圓形水池直徑120 cm，高60 cm，水池中水面高約28 cm；圓柱形有機(jī)玻璃平臺直徑14 cm,高25 cm，位于水面下23 cm處。室溫及水溫均保持在（22±2）；測試時以鮮牛奶加水?dāng)嚋喼量床坏狡脚_為止。大鼠于測試前將頭頸部用苦味酸涂黃。圓形水池分成四個象限，平臺放置于第1象限的中心位置，大

7、鼠沿1至4象限的順序在每個象限的固定入水點(diǎn)處放入水池。水面上方1.5 m處的攝像機(jī)連接于路徑追蹤系統(tǒng)，可追蹤大鼠頭頸部黃色標(biāo)記，并拍攝記錄其在水中的游走軌跡。通過計算機(jī)軟件分析逃避潛伏期即大鼠從入水至找到并爬上平臺所需的時間。Morris水迷宮實(shí)驗連續(xù)7天。第1天至第6天，進(jìn)行定位航行實(shí)驗，按1、2、3、4象限的順序在入水點(diǎn)處將大鼠頭朝池壁輕輕放入水中，記錄120 s內(nèi)的逃避潛伏期，取其平均值作為學(xué)習(xí)能力指標(biāo)。第7天為空間搜索實(shí)驗，撤掉平臺，僅在一固定象限將大鼠放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠穿過原平臺位置的次數(shù)，作為記憶能力的指標(biāo)。     &

8、#160;                       1.3.4 被動回避性跳臺反射實(shí)驗水迷宮實(shí)驗結(jié)束后進(jìn)行。第1天將大鼠放入跳臺儀的反應(yīng)箱中,適應(yīng)環(huán)境3 min后通以36 V交流電,大鼠受到電擊后，多數(shù)跳上絕緣平臺逃避電擊。大鼠可能再次或多次跳至銅柵上后又跳回絕緣平臺，如此訓(xùn)練5 min，記錄大鼠的跳臺次數(shù)，又稱錯誤次數(shù)，以此作為學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，24 h后重新測

9、試,先將大鼠放在絕緣平臺上，在銅柵上通電并開始計時，記錄大鼠第一次跳下平臺所用的時間作為潛伏期，以 5min內(nèi)跳下的次數(shù)作為錯誤次數(shù)，將上述兩項作為大鼠記憶能力的指標(biāo)。1.3.5 Bielschowsky銀染色改良法 跳臺實(shí)驗結(jié)束后，將大鼠快速斷頭處死，冰上取腦。福爾馬林浸泡固定，切取海馬注射點(diǎn)前后約3 mm厚腦組織，經(jīng)脫水、透明、浸蠟及石蠟包埋后，經(jīng)冠狀面切片，片厚3 m。切片脫蠟至水，放入預(yù)先加熱至37的20%硝酸銀溶液內(nèi)30 min，蒸餾水速洗，入10%中性甲醛液還原20 s，Marsland氏銀氨溶液中作用30 s，取出切片去除多余的銀溶液，再入10%中性甲醛液還原1 min，蒸餾水沖

10、洗，入5%硫代硫酸鈉水溶液中作用約5 min，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片，AX70 OLYMPUS光學(xué)顯微鏡觀察，銀染色處呈黑色，背景呈黃色。1.4 統(tǒng)計學(xué)分析行為學(xué)結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間差異用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗分析。2 結(jié) 果2.1 Morris水迷宮實(shí)驗定位航行試驗：各組大鼠在前3天的學(xué)習(xí)中，逃避潛伏期并無明顯差異。第4天至第6天，與正常對照組相比AD模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P0.01）。與AD模型組相比，溶媒組無顯著性差異；銀杏達(dá)莫組、人參皂苷Rg2各劑量組逃避潛伏期均明顯縮短(P0.01或P0.05)。人參皂苷Rg2各劑量組與銀杏達(dá)莫組相比，第

11、4天時，人參皂苷Rg2低劑量組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(P0.01），其余均無明顯差異?？臻g搜索試驗：與正常對照組大鼠相比，AD模型組大鼠穿臺次數(shù)明顯減少(P0.01)。與AD模型組相比，溶媒組大鼠穿臺次數(shù)無顯著差異；銀杏達(dá)莫組、人參皂苷Rg2中、高劑量組大鼠穿臺次數(shù)均明顯多于AD模型組(P0.05)；人參皂苷Rg2低劑量組大鼠穿臺次數(shù)雖高于AD模型組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。人參皂苷Rg2各劑量組大鼠穿臺次數(shù)均低于銀杏達(dá)莫注射液組，尤其是人參皂苷Rg2低劑量組更為明顯(P0.05），見表1。表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗結(jié)果(略)2.2 被動回避性跳臺反射實(shí)驗與正常對照組相比，AD模型組大鼠第

12、1天、第2天錯誤次數(shù)明顯增多，潛伏期明顯縮短（P0.01）。與AD模型組大鼠相比，溶媒組的錯誤次數(shù)和潛伏期均無明顯變化；銀杏達(dá)莫組、人參皂苷Rg2中、高劑量組的潛伏期延長和錯誤次數(shù)減少,均有顯著性差異（P0.01或P0.05）；低劑量組的潛伏期較模型組明顯延長（P0.01），錯誤次數(shù)雖有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。人參皂苷Rg2各劑量組與銀杏達(dá)莫組相比，低劑量組大鼠潛伏期顯著低于銀杏達(dá)莫組（P0.05），但錯誤次數(shù)無明顯變化;中、高劑量組大鼠的錯誤次數(shù)與潛伏期均無明顯變化。見表2。表2 各組大鼠被動回避性跳臺反射實(shí)驗結(jié)果(略)2.3 Bielschowsky 銀染色改良法正常對照組、銀杏達(dá)莫組、

13、人參皂苷Rg2中、高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)均未見SP形成；AD模型組、溶媒組、人參皂苷Rg2低劑量組大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)可見SP，呈均勻致密的嗜銀團(tuán)（圖1）。3 討 論 人參皂苷三醇型中的Rg1是目前研究發(fā)現(xiàn)的人參皂苷中對AD治療作用較為顯著的一種。人參皂苷Rg2與Rg1同屬三醇型，但其對AD的防治作用目前少見報道。本實(shí)驗中Morris水迷宮實(shí)驗結(jié)果證實(shí)AD模型組與溶媒組大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力低下，說明AD模型建立成功。人參皂苷Rg2低劑量組大鼠學(xué)習(xí)能力有一定的提高，而人參皂苷Rg2中、高劑量組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力則有顯著性的提高。被動回避性跳臺反射實(shí)驗結(jié)果則顯示人參皂苷Rg2各劑量組大鼠的學(xué)習(xí)能力

14、均有明顯改善，尤以高劑量組最為明顯；人參皂苷Rg2中、高劑量組大鼠記憶能力有所提高。兩項行為學(xué)檢測指標(biāo)的結(jié)果基本相同，表明人參皂苷Rg2對AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力具有一定的改善作用，并且隨著給藥劑量的加大，效果更為明顯。                              SP是AD的主要病理特征，而A是SP的

15、主要成分。A是由淀粉樣前體蛋白（APP）裂解產(chǎn)生的。APP是人體各種組織中廣泛存在的一種跨膜蛋白，在正常情況下，它只裂解產(chǎn)生極少量的A3。但是，在一些遺傳和非遺傳因素的影響下，APP代謝異常，可產(chǎn)生過多的A在大腦皮質(zhì)和海馬中沉積，形成SP。SP在AD的發(fā)病過程中起著非常重要的作用。A沉積具有細(xì)胞毒性作用，能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。Bcl2是重要的神經(jīng)元凋亡抑制基因 4，而Bax能促使神經(jīng)元凋亡，它們構(gòu)成了一對平衡體系。Paradis等5研究發(fā)現(xiàn)，A能使Bcl2表達(dá)減弱，Bax表達(dá)增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。A能夠激活腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，使這兩種細(xì)胞圍繞在SP的周圍6?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞能產(chǎn)

16、生大量炎性因子，如IL1，IL6，并產(chǎn)生補(bǔ)體成分，如C1r,C1q等，誘發(fā)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和自身免疫反應(yīng)，損傷神經(jīng)元7。另外，A還能導(dǎo)致突觸功能異常，是認(rèn)知障礙的重要原因8。有研究發(fā)現(xiàn)9，人參皂苷Rg2能使Bcl2、HSP70的表達(dá)增多，Bax、P53的表達(dá)減少，說明人參皂苷Rg2具有調(diào)整凋亡蛋白表達(dá)的能力，從而抑制A沉積誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡， 因而能保護(hù)學(xué)習(xí)記憶能力，從而起到預(yù)防AD的作用。 已有實(shí)驗證實(shí)10，銀杏葉提取物能有效提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并明顯減少SP沉積。因此，本實(shí)驗采用銀杏達(dá)莫注射液作為陽性對照藥物。實(shí)驗結(jié)果顯示，與AD模型組相比，銀杏達(dá)莫組和人參皂苷Rg2各劑量組大鼠的學(xué)習(xí)記

17、憶能力均有所增強(qiáng)，除人參皂苷Rg2低劑量組外，大腦皮質(zhì)及海馬內(nèi)均未見SP，說明人參皂苷Rg2能一定程度的抑制SP的形成，可能對AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力起到了一定的保護(hù)作用。但其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討和研究。【參考文獻(xiàn)】 1 王曉英，陳 霽，張均田.人參皂甙Rg1對淀粉樣肽（2535）側(cè)腦室注射所致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其機(jī)制J.藥學(xué)學(xué)報，2001；36（1）：14.2 Paxinos G,Watson C.The Rat Brain in Stereotaxic CoordinatesM. Sydney:Academic Press，1986：580.3 Torreilles

18、 F，Touchon J.Pathogenic theories and intrathecal analysis of the sporadic form of Alzheimers diseaseJ.Prog Neurobiol，2002；66(3):191203.4 Merry DE,Korsmeyer SJ.Bcl2 gene family in the nervous systemJ. Annu Rev Neurosci,1997；20:24567.5 Paradis E,Douillard H,Koutroumanis M,et al.Amyloid beta peptide of Alzheimers disease downregulates Bcl2 and upregulates bax expression in human neuronsJ.J Neurosci，1996；16(23):75339.6 Frautschy SA,Yang F,Irrizarry M,et al.Microglial response to amyloid p