TAIL - PCR方法快速分離Xcc致病相關(guān)基因序列[1]-

1、18卷2期2002年3月生物工程學(xué)報ChineseJournal of Biotechnology Vol.18No.2March 2002收稿日期:2001208210,修回日期:2001210225。基金項目:中國科學(xué)院創(chuàng)新方向基金資助(No.KXCX221202201。3通訊作者。Tel:86210262642536;E 2mail:heczTAIL 2PCR 方法快速分離Xcc 致病相關(guān)基因序列應(yīng)革武威何朝族3(中國科學(xué)院微生物研究所北京100080摘要以mini 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子中npt II 片段作為探針,對已獲得的五株野油菜黃單胞菌野油菜黑腐病致病型(Xcc 非致病

2、突變體進(jìn)行了Southernblot 分析,結(jié)果表明,這五株突變體確由mini 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子插入致病相關(guān)基因所致,且為單拷貝不同位點的插入。提取這五株突變體總DNA 作為模板,采用改進(jìn)的熱不對稱交錯PCR (TAIL 2PCR 方法從其中克隆到了各自轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列,對這些側(cè)翼序列進(jìn)行了序列測定并將分析結(jié)果與GenBank database 及Xcc 全基因組序列做了比較,結(jié)果表明,五個側(cè)翼序列所在的基因確與Xcc 致病性有關(guān)。這種改進(jìn)后的TAIL 2PCR 方法為突變體特別是轉(zhuǎn)座子插入突變體中目的基因的克隆提供了一種簡便高效的新方法。關(guān)鍵詞Xcc ,致病相關(guān)基因,min

3、i 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子,TAIL 2PCR中圖分類號Q781文獻(xiàn)標(biāo)識碼A 文章編號100023061(2002022*野油菜黃單胞菌野油菜黑腐病致病型Xan 2thomonos campestris pv.campestris (Parmel Dowson 簡稱Xcc 為假單胞菌科、黃單胞菌屬的革蘭氏陰性桿菌,可侵染大白菜、中國甘藍(lán)、球莖甘藍(lán)、蘿卜、油菜、花椰菜等大多數(shù)十字花科作物而引起黑腐病(Black rot,俗稱半邊癱,被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)對該科作物危害最為嚴(yán)重的病原菌。在熱帶、亞熱帶地區(qū)如我國南方,由于溫度、濕度適宜,病害尤為嚴(yán)重,對其防治措施的研究具有重要的現(xiàn)實意義1。植物

4、病害的發(fā)生實質(zhì)上是一定條件下植物與病原兩者間一系列基因或基因產(chǎn)物相互作用的結(jié)果,因而對其防治的研究必然涉及植物抗病機(jī)制和病原致病機(jī)制兩個方面2。對于后者來說,病原必須克服植物的一系列防御反應(yīng)才能成功地引起病害,可見其致病過程十分復(fù)雜,相關(guān)的基因必然很多,要深入了解病原致病的分子機(jī)制,就必須對這些基因進(jìn)行分離與分析。自80年代以來,Xcc 已作為一種模式病菌從其中鑒定和克隆出了許多致病相關(guān)基因,并對他們的結(jié)構(gòu)與功能等作了深入分析3,4。本研究在已獲得的5株Xcc 致病相關(guān)基因mini 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子插入突變體的基礎(chǔ)上,通過各種方法比較,最終選用經(jīng)過改進(jìn)后的熱不對稱交錯PCR5(T

5、hermalasymmetricinterlacedPCR 簡稱TAIL 2PCR 方法從這些突變體中成功地克隆到了各自的致病相關(guān)基因,為今后的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ);同時,這種改進(jìn)后的TAIL 2PCR 方法也為其它突變體特別是轉(zhuǎn)座子插入突變體中目的基因的克隆提供了一種新方法,與其他基因克隆方法尤其是經(jīng)典的質(zhì)粒拯救方法相比,本方法具有明顯的簡便、快速、高效、特異等優(yōu)點。1材料與方法1.1實驗材料1.1.1菌株與質(zhì)粒:Xcc 致病相關(guān)基因的mini 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子插入突變體15#由本室制備(有關(guān)它們的具體制備方法和表型將另文發(fā)表;質(zhì)粒pTGN 6(含mini 2Tn5gfp 2km

6、 轉(zhuǎn)座子由新加坡Pan ShenQ.博士惠贈;Xcc 野生型菌株CN 和8004、E .coli DH5由本室保存。1.1.2試劑與其他:同位素32P 購自Dupont 公司;探針標(biāo)記試劑盒Ready 2To 2Go TmDNALabellingBeads (2dCTP 購自AmershamPharmacia 公司;DNA 片段回收試劑盒E.Z.N.AGelExtractionKit 、質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.APlasmidMiniprepKit 購自O(shè)mega公司;T 2載體系統(tǒng)pGEM 2TEasyVectorSystems 購自Promega 公司;3種Taq 酶分別來自上海生工生物

7、工程技術(shù)服務(wù)公司(Taq、Taqpluspolymerase及本室;限制性核酸內(nèi)切酶均來自GIBCO公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成;測序由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成;Xcc基因組文庫由本室構(gòu)建。1.2實驗方法1.2.1Xcc非致病突變體及野生型基因組DNA的提取:各取1.5mL Xcc非致病突變體15#及野生型Xcc CN、Xcc8004的過夜液體培養(yǎng)物離心收集菌體,加400L裂解液(40mmolLTris2HAc、20mmolL pH7.8NaAc、1mmolLEDTA、1%SDS及200L5molL NaCl溶液將菌體沉淀吹打混勻后離心收集上清,等體積氯仿抽提兩次,兩倍體積

8、無水乙醇離心沉淀, 70%乙醇洗滌,最后溶于適量ddH2O中。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.2.2Xcc非致病突變體中mini2Tn5gfp2km轉(zhuǎn)座子插入的檢測:各取1g Xcc非致病突變體與野生型Xcc的基因組DNA及50ngpTGN質(zhì)粒用Sma I酶切過夜,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,堿法7轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。再以primer1、primer2為引物,從pTGN質(zhì)粒中擴(kuò)增npt片段,以32P標(biāo)記為探針進(jìn)行Southern雜交,檢測Xcc非致病突變體中mini2Tn5gfp2km轉(zhuǎn)座子插入情況。primer1:52GGTGCCCTGAATGAACTG23primer2:52TAGCCAACGCTAT

9、GTCCT231.2.3TAIL2PCR方法克隆mini2Tn5gfp2km轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列:根據(jù)獲知的gfp序列,在其5端設(shè)計3個向外的特異性巢式引物sp1、sp2、sp3(見圖1,再參照文獻(xiàn)6,8設(shè)計7個隨機(jī)簡并引物AD1 7(見表1,同時準(zhǔn)備3種Taq酶,然后以20ng的15#突變體基因組DNA為模板,3個特異性巢式引物與任一種隨機(jī)引物及任一種Taq酶組合進(jìn)行TAIL2PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見表2、表3。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物大小。1.2.4TAIL2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序:TAIL2PCR的最終產(chǎn)物與T載體pGEM2TEasy連接后電激轉(zhuǎn)化E. coli DH5感受態(tài)

10、細(xì)胞,藍(lán)白篩選陽性克隆后,提取并純化質(zhì)粒,再取少量質(zhì)粒用Eco R酶切鑒定,對插入片段大于300bp的重組質(zhì)粒測序。1.2.5與Xcc基因組全序列的比較:測序結(jié)果中去除T載體pGEM2TEasy序列、mini2Tn5gfp2km轉(zhuǎn)座子序列及隨機(jī)引物序列后得到轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列,分別與Xcc基因組序列、GenBankdatabase作Blastn、Blastx比較,得到目的基因的結(jié)構(gòu)及可能的功能信息 。圖1pTGN質(zhì)粒中轉(zhuǎn)座子mini2Tn5gfp2km的結(jié)構(gòu)及TAIL2PCR特異性引物在其上的位置Fig.1Structureofmini2Tn5gfp2km transposoninpTGNa

11、ndsitesofspecialprimersusedforTAIL2PCRonitThe gfp2npt IIoperonispromoter2less.TheGFPORFcontaineditsown startcodonandthe atpE,translationalsignal.TheNptIIORFincluded itsownribosome2bindingsite(RBSandstartcodon.GmRrepresentsthe geneencodinggentamicinresistance;atpE,theefficienttranslationregion ofthe

12、E.coli atpE gene;IandO,invertedrepeatsofIS50;tnp,thegene encodingTn5transposase;oriT.RP4transferorigin;oriV,R6Koriginof replication.SpecialprimersusedforTAIL2PCRwerecomplementaryto gfp ofmini2Tn5gfp2km.Thedistancefrom5terminusof gfp toOregion was120bp表1隨機(jī)簡并引物Table1ADPrimersPrimerNo PrimersequenceADP

13、rimers152NTCGA(GCT(ATT(GCG(ATGTT23ADPrimers252NGTCGA(GC(ATGANA(ATGAA23ADPrimers352(ATGTGNAG(ATANCANAGA23ADPrimers452TG(ATGNAG(ATANCA(GCAGA23ADPrimers552AG(ATGNAG(ATANCA(ATAGG23ADPrimers652CA(ATCGICNGAIA(GCGAA23ADPrimers752TC(GCTICGNACIT(ATGGA23表2TAIL2PCR反應(yīng)混合液的組成Table2ThecomposeofTAIL2PCRreactionmixt

14、ureReagentAmountinPrimaryreactionmixtureLAmountinSecondreactionmixtureLAmountinTertiaryreactionmixtureL 10xbuffer2222222mmolLdNTPs105525pmolLAD20202020pmolLSP.111Taq(5UL222ddH2Oto200200200(Eachreactionaliquotcontained18LofTAIL2PCRmixtureandto which2Ldilutedtemplatewasadded。ForthesecondaryandTertiary

15、PCR, Templatecamefromtheproductoflastcycleandwasdiluted100timesbefore reaction.3812期應(yīng)革等:TAIL2PCR方法快速分離Xcc致病相關(guān)基因序列表3TAIL 2PCR 反應(yīng)條件Table3CyclingconditionsusedforTAIL 2PCRReaction FileNo Thermalcyclingcondition CycleNoPrimary1922min,951min 129515s,6115s,7230s 539515s,253min,rampingto 72over3min,722min1

16、49515s,4415s,7230s 359510s,6115s,7230s 9510s,6115s,7230s 9510s,4415s,7230s126725min1 Secondary79510s,5915s,7230s 9510s,5915s,7230s 9510s,4815s,7230s136725min1Tertiary89510s,6115s,7230s 9510s,6115s,7230s 9510s,4815s,7230s136725min12結(jié)果與分析2.1 Xcc 非致病突變體15#與野生型Xcc CN 、8004基因組DNA 的提取及突變體中mini 2Tn5gfp 2km

17、 轉(zhuǎn)座子插入的檢測用1.2.1中所述方法分別提取到Xcc 非致病突變體15#及野生型Xcc CN 、8004基因組DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測大小在30kb 以上(結(jié)果略。再以上述基因組DNA 進(jìn)行Southernblot 分析,Xcc 野生型CN 和8004無mini 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子插入作為負(fù)對照,結(jié)果確為陰性;pTGN 質(zhì)粒含mini 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子作為正對照,結(jié)果確為陽性;突變體15#中都有mini 2Tn5gfp 2km 插入,且為單拷貝不同位點的插入,表明這些突變確由mini 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子插入所致,而且是不同位點的突變(見圖2。2.

18、2Xcc 非致病突變體中插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列的克隆及測序在1%瓊脂糖凝膠上各取適量TAIL 2PCR 第二輪及第三輪擴(kuò)增產(chǎn)物電泳。第三輪產(chǎn)物比第二輪產(chǎn)物稍小,但大于300bp 者為陽性,且只有一條帶為最佳(4#結(jié)果見圖3,其余略。經(jīng)過不同組合,5株突變體的第三輪陽性產(chǎn)物全部得到(見表4。分別與T 載體pGEM 2TEasy 連接、克隆后,Eco RI 酶切鑒定結(jié)果均符合要求(4#結(jié)果見圖4,其余略。重組質(zhì)粒測序結(jié)果略。圖2突變株中mini 2Tn5gfp 2km 轉(zhuǎn)座子插入的Southernblot 分析Fig.2Southernblotanalysisofmini 2Tn5gfp 2kminser

19、tionofmutants1.Sma I 2digestedpTGN,mini 2Tn5gfp 2km positivecontrolDNA;2&3.Sma I 2digestedgenomicDNAof Xcc CN,8004,mini 2Tn5gfp 2km negativecontrolDNA;48.Sma I 2digestedgenomicDNAof Xcc nonpathogenicmutants15#表4五株突變體TAIL 2PCR 反應(yīng)組合及結(jié)果Table4ResultsandcompositionsofTAIL 2PCRof5mutantsAssemblyofTAIL

20、 2PCRelementLengthofTAIL 2PCRfinalproduct bps1#sp123、AD2、Taqpol.13452#sp123、AD6、Taqpol.23213#sp123、AD7、Taqpol.23884#sp123、AD3、Taqpol.34305#sp123、AD7、Taqpol.3588(Taqpol.1:TaqpolymerasefromSangon,Shanghai;Taqpol.2:TaqpluspolymerasefromSangon,Shanghai;Taqpol.3:Taqpolymerasefromour ownlaboratory.圖34#突變體

21、TAIL 2PCR 結(jié)果的電泳分析Fig.3ElectrophoresisanalysisofTAIL 2PCRproductofmutant4#1.DL 22000marker;2.ProductoftertiaryPCRreaction;3.ProductofsecondaryPCRreaction481生物工程學(xué)報18卷 圖44#突變體插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列的酶切鑒定Fig.4Identificationofthesequenceflank 2ing insertionsiteinmutant4#bydigestion1.1kbmarker (AmershamPharmacia ;2&3

22、.LinkingproductwithpGEM 2TEasyvectorinclone1;4&5.LinkingproductwithpGEM2TEasyvectorinclone2(2&4.Linkingproduct;3&5.Eco RI 2digestedlinkingproduct ;6.Eco RI 2digestedpGEM 2TEasyvector;7.DL22000marker;8.pGEM 2TEasyvector2.3Xcc 非致病突變體中插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列與Xcc基因組全序列的比較4#轉(zhuǎn)座子插入?yún)^(qū)側(cè)翼序列全長187bp,與Xcc基因組全序列相比較,同源

23、性為100%,所在位點為427717824277364bp,所在ORF 為427943024277154bp;再與GenBankdatabase 相比較,與Xcc XC1708xpsDprecursor (M81648.1核酸序列的同源性為100%。XpsDprecursor (AAA27615.1是一種已知外膜蛋白,作為Xcc 蛋白分泌系統(tǒng)的組成部分,與果膠酶、2淀粉酶、葡聚糖內(nèi)切酶等胞外酶的分泌密切相關(guān),它的突變將導(dǎo)致胞外酶在周質(zhì)空間中的積累,是一種致病相關(guān)因子13,14。這表明4#突變體的確是致病基因發(fā)生了插入突變。其余突變體的比較結(jié)果中,2#、3#、5#分別與已知致病因子調(diào)節(jié)基因、磷酸

24、核糖表位酶基因及外膜蛋白基因同源性較高(>60%,1#的同源性較低(<30%,推測可能為新基因,結(jié)果將另文發(fā)表。3討論本實驗采用改進(jìn)的TAIL 2PCR 的方法從5株Xcc 非致病突變體中成功地克隆出了各自相關(guān)基因。結(jié)果表明,所得5個相關(guān)基因確與Xcc 致病性有關(guān)。下一步的工作中我們準(zhǔn)備對克隆得到的這幾個基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控等做進(jìn)一步的分析。當(dāng)前,隨著后基因組時代的來臨,功能基因組學(xué)的研究迫切需要了解基因組時代所釋放的大量未知基因的功能,制備突變體是一種非常有效的解決辦法,而轉(zhuǎn)座子插入突變已成為制備突變體的常規(guī)選擇9,IgorY.Goryshin 等10利用體外制備的Tn5轉(zhuǎn)

25、座復(fù)合物電激制備轉(zhuǎn)座插入突變體則更將這一方法推陳出新11。但接下來從轉(zhuǎn)座插入突變體中克隆相關(guān)基因的方法有很多12,本實驗報道的TAIL 2PCR方法與其它方法尤其是經(jīng)典的質(zhì)粒拯救方法相比,具有明顯的優(yōu)點,例如:它簡便、快速,通常一次反應(yīng)6、7h 后就可見結(jié)果,而質(zhì)粒拯救法最少3天;另外它特異、高效,只要PCR 最終產(chǎn)物符合大小要求,T載體連接轉(zhuǎn)化后陽性克隆比例高,不含側(cè)翼序列的假陽性克隆比例很低,篩選容易,而質(zhì)粒拯救法所得假陽性克隆比例則很高,精度差,因而篩選繁瑣,工作量大;還有,由于它操作程序化,引物可通用,尤其適合于同時處理大批量樣品,有自動化應(yīng)用的前景。當(dāng)然,TAIL 2PCR 方法也有

26、缺陷,如不是每次反應(yīng)都有陽性結(jié)果,需要的組合可能較多等等。但總的來說,TAIL 2PCR 不失為一種簡便高效的基因克隆方法,尤其在后基因組時代可作為突變體研究的良好的技術(shù)平臺,值得改進(jìn)與推廣。本研究中,為達(dá)到更好的效果,我們已經(jīng)對TAIL 2PCR 方法做了一些改進(jìn)。首先,我們在第三輪PCR 中仍采用TAIL 循環(huán)而不是經(jīng)典循環(huán),既增加了最終產(chǎn)物中目的片段的豐度又大大降低了非特異性產(chǎn)物的干擾;其次,我們用3種不同的Taq 酶與已有隨機(jī)簡并引物組合,大大增加了可選性與成功率(具體原因尚待探討;還有,鑒于用TAIL 2PCR 最終產(chǎn)物直接測序(文獻(xiàn)5中推薦效果不好,我們將之首先轉(zhuǎn)入T 載體中(之前

27、未經(jīng)純化,轉(zhuǎn)化鑒定后再送測菌株或質(zhì)粒,效果非常理想。需要特別注意的是:考慮到特異引物并不總在已知序列最末端,因此可用的TAIL 2PCR 最終產(chǎn)物必須滿足一定的大小(本實驗中需不小于300bp ,否則不能包含側(cè)翼序列在內(nèi)。REFERENCES(參考文獻(xiàn)1Swings JG,CiveroloEL.Xanthomonas 1stedtion,London:Chapman&Hall,1993,pp.51552AlanCollmer,Determinationofpatho 2genicityandavirulenceinplantpathogenicbacteria.Current opin

28、ion in plant biology ,1998,1:3293353TsengYi 2hsiung,ChoyKa 2tim et al ,ChromosomemapofXan 2thomonas campes 2tris pv.campestris 17withlocationsofgenesin2volvedinXanthangumsynthesisandyellowpigmentation.Journal ofbacteriology ,1999,181:1171254WEIK (韋柯,TANGJL (唐紀(jì)良,FENGJX (馮家勛.Cloning5812期應(yīng)革等:TAIL 2PCR

29、方法快速分離Xcc 致病相關(guān)基因序列ofaDNAFragmentfromXanthomonas campestris pv.campestrisComplemen 2tingitsExopolysaccharideDeficientMutantT113.Jour 2nal of Gangxi agricultural and biological science (廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),1999,18:15195LiuYao 2Guang,RobertF.Whittier,ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandseque

30、ncingofinsertendfrag 2mentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.GENOM 2ICS ,1995,25:6746816TANGX,LUBF,PANSQ.Abifunctionaltransposonmini2Tn5gfp 2km whichcanbeusedtoselectforpromoterfusionsandre 2portgeneexpressionlevelsinAgrobacteriumtumefaciens.FEMS Mi 2crobiologyLetters ,1999,179:37427SambrookJ,F

31、ritschEF,ManiatisT.MolecularCloning :A Laborato 2ry Manual ,2ndEdition,Beijing:Sciencepress,1992,pp.4804828SergueiParinov,MayalaguSevugan,DeYe et al .Analysisofflankingsequen 2cesfromdissociationinsertionlines:adatabaseforreverse geneticsin Arabidopsis .The Plant Cell ,1999,11:226322709YANGL (楊琳,WAN

32、GJF (王金發(fā).Thetransposontagintheplantgeneengineering.Biotechnology (生物技術(shù),2000,10:222710IgnorY.Goryshin,JerryJendrisak,LesM.Hoffman,et al .Reznikoff,Insertionaltransposonmutagenesisbyelectroporationofreleased Tn5transpositioncomplexes,Nature biotech 2nology ,2000,18:9710011MagalieR.Guilhabert,LesMHoff2

33、man,DavidA.Mills.Kirk 2patrick,Transposonmutagene 2sisof Xylella fastidiosa byelectropora 2tionofTn5synapticcomplexes.Molecular plant 2microbe interactions ,2001,14:70170612SUNCX (孫春曉,YUCH (于常海et al .Abriefintroductiontothemethodsfornovelgenecloning.Progressin physiologicalsciences(生理科學(xué)進(jìn)展,2000,31:35

34、4213LeeHM,WangC,LIUYL,et al .Associaionofthecytoplasmic 2membraneproteinXpsNwiththeoutermembraneproteinXpsDinthe typeIIproteinsecretionapparatusofXan 2thomonas campestris pv.campestris .J Bacteriol ,2000,182:1549155714HuNT,HungMN,ChiouSJ,et al .Cloningandcharacterizationofagenerequiredforthesecretionofextracellularenzymesacrossthe outermembraneby Xanthomonas campes 2tris pv.campestris .J Bac 2teriol ,1992,174:26792687Cloningof Xanthomonas campestris pv.campestris Pathogenicity 2relatedGeneSequencesbyTAIL 2PCRYINGGe WUWei HEChao 2Zu 3(Institute of Microbiology