凋亡蛋白Daxx與TRAF3相互作用的篩選及相互作用位點(diǎn)的鑒定

1、凋亡蛋白Daxx與TRAF3相互作用的篩選及相互作用位點(diǎn)的鑒定                                  作者：張翠莉，成海恩，王應(yīng)雄 【摘要】  目的: 利用酵母雙雜交技術(shù)在成人肝文庫(kù)中篩選能與死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（Daxx）相互作用的

2、蛋白，并用哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了免疫共沉淀驗(yàn)證，以進(jìn)一步了解Daxx的功能. 方法: 利用PCR在成人肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增Daxx全長(zhǎng)ORF，構(gòu)建pDBLeuDaxx載體. 轉(zhuǎn)化MaV203，檢測(cè)細(xì)胞毒性和自激活作用，確定His基礎(chǔ)表達(dá)的3AT濃度. 依次轉(zhuǎn)化成人肝cDNA文庫(kù). 在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上挑取三陽(yáng)性克隆. 進(jìn)行回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀驗(yàn)證，并利用gal分析進(jìn)行了相互作用結(jié)構(gòu)域的鑒定. 結(jié)果: 篩庫(kù)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到5.8×106個(gè)克隆. 篩選到了一株能與Daxx相互作用的陽(yáng)性克隆，DNA序列分析和同源檢索表明該陽(yáng)性克隆為腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TRAF3）.通過(guò)回轉(zhuǎn)及coIP證實(shí)

3、了TRAF3能與Daxx相互作用，gal分析發(fā)現(xiàn)TRAF3通過(guò)TRAF Domain與Daxx相互作用. 結(jié)論: TRAF3通過(guò)TRAF Domain與Daxx相互作用，可能參與了Daxx的調(diào)控和功能，為進(jìn)一步了解Daxx作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】  凋亡0引言死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（death domainassociated protein， Daxx）在核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控子發(fā)揮促凋亡作用1 ；另一方面，在各種凋亡刺激下，Daxx可以從核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，介導(dǎo)腫瘤壞死因子受體(TNFR) 超家族成員促凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo). Daxx和FADD分別是Fas下游的兩條截然不同的凋亡通路.

4、 Daxx通過(guò)活化JNK通路，不依賴于caspase,參與凋亡的活化2. 隨著大量的研究，Daxx的促凋亡功能受到了挑戰(zhàn). 如Michaelson等3發(fā)現(xiàn)缺乏Daxx 基因的鼠胚胎發(fā)育受損,大量胚胎干細(xì)胞系出現(xiàn)凋亡,他提出Daxx基因是胚胎發(fā)育所必需的,直接或間接起著防止凋亡的作用. 由于Daxx在凋亡方面矛盾的功能，通過(guò)對(duì)Daxx和其他蛋白質(zhì)之間相互作用的研究，來(lái)了解Daxx的調(diào)控和功能，具有非常重要的意義. 我們利用酵母雙雜交技術(shù)，以Daxx為誘餌在成人肝cDNA文庫(kù)中篩選相互作用蛋白，以期為進(jìn)一步研究Daxx作用機(jī)制提供有用的線索.1材料和方法1.1材料酵母雙雜交系統(tǒng)ProQuestTM

5、 Two Hybrid System (CAT SERIES 10835)、成人肝cDNA文庫(kù)ProQuestTM premade cDNA library (Human Liver)購(gòu)于Invitrogen 公司. JM109感受態(tài)、HepG2細(xì)胞為本室保存. pCMVMyc是Clontech公司產(chǎn)品，pFLAGCMV2是Sigma公司產(chǎn)品. 各種生化試劑購(gòu)于北京百靈克生物科技公司. 引物由北京賽百盛公司合成. 序列測(cè)定由北京奧科公司完成.Daxx載體的構(gòu)建利用PCR在成人肝文庫(kù)中擴(kuò)增全長(zhǎng)的Daxx開(kāi)放閱讀框，Daxx引物序列設(shè)計(jì)如下，P1:    &

6、#160; 5GCG TCG ACC ATG GCC ACC GCT AAC AGC ATC3; P2：5TTG CGG CCG CTA ATC AG AGT CTG AGA GCA3；PCR 反應(yīng)的條件: 94預(yù)變性4 min; 94變性45 s, 64退火45 s, 72延伸2 min, 30個(gè)循環(huán), 最后72延伸7 min. 將回收的PCR片段利用Sal和Not I酶切，隨后與同樣酶切好的pDBLeu載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài),經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑選陽(yáng)性克隆，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定后測(cè)定DNA序列.1.2.2誘餌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和3AT的確定將所構(gòu)建好的pDBLeuD

7、axx轉(zhuǎn)化到酵母MaV203中，通過(guò)對(duì)3氨基1，2，4三唑（3Amino1,2,4Triazole，3AT）濃度梯度平板上的生長(zhǎng)情況來(lái)確定抑制His基礎(chǔ)表達(dá)的3AT水平，觀察有無(wú)自激活作用.1.2.3雙雜交系統(tǒng)對(duì)成人肝CDNA文庫(kù)的篩選和陽(yáng)性克隆的鑒定用轉(zhuǎn)化了Daxx的酵母制備感受態(tài)，然后轉(zhuǎn)化成人肝CDNA文庫(kù)質(zhì)粒，通過(guò)對(duì)His, Ura和Xgal的分析，對(duì)轉(zhuǎn)化的酵母進(jìn)行篩選. 提取能同時(shí)激活三個(gè)報(bào)告基因的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài),經(jīng)氨芐抗性篩選，提取獵物質(zhì)粒. 1.2.4三陽(yáng)性克隆的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證和序列分析將候選質(zhì)粒與Daxx回轉(zhuǎn)酵母MaV203，驗(yàn)證表型. 將回轉(zhuǎn)陽(yáng)性的質(zhì)粒送

8、公司測(cè)序. 隨后利用NCBI上BLAST工具，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析.1.2.5Xgal定性分析TRAF3和Daxx相互作用位點(diǎn)1.2.5.1TRAF3缺失體的pPC86載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)候選克隆TRAF3的一系列缺失體引物,利用所設(shè)計(jì)的引物在HepG2細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增TRAF3及其缺失體，回收PCR片段，然后進(jìn)行Sal I和Not I雙酶切，連接pPC86，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，氨芐抗性篩選. 挑陽(yáng)性克隆PCR和酶切鑒定，送測(cè)序.1.2.5.2TRAF3與Daxx相互作用位點(diǎn)的鑒定將TRAF3及其缺失體與Daxx共轉(zhuǎn)酵母MaV203，挑取菌落到覆蓋有無(wú)菌Whatman濾紙的YPAD平板

9、上，液氮反復(fù)凍融，加入Z buffer/Xgal溶液，30， 觀察24 h內(nèi)菌落是否變藍(lán)，以確定相互作用位點(diǎn).1.2.6TRAF3和Daxx相互作用位點(diǎn)的定量分析將TRAF3缺失體與Daxx共轉(zhuǎn)的單克隆接種于2.5 mL SCLeuTrp培養(yǎng)液中，搖床過(guò)夜. 將1 ml過(guò)夜培養(yǎng)物部分接種于5 mL YPAD培養(yǎng)液中，使A600 nm約為0.5，30，搖床直到A600 nm為1.01.5. 將細(xì)胞培養(yǎng)物分裝在1.5 mL EP管中，14 000 g離心30 s,小心去除上清. 每管細(xì)胞沉淀用100 L Buffer 1 重懸，加入直徑為0.5 mm的酸洗玻璃珠，使終體積為200 L. 渦懸12

10、min. 準(zhǔn)備空白對(duì)照，空白對(duì)照組成為100 L  Buffer 1和900 L Buffer 2. 每個(gè)樣品中加入900 L Buffer2，渦懸使混合充分，開(kāi)始計(jì)時(shí). 觀察顏色的變化，出現(xiàn)修黃色到棕紅色后，空白對(duì)照和陽(yáng)平管中都加入250 L 6 mmol/L ZnCl2終止反應(yīng)，記錄顏色消逝的時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間在24 h范圍內(nèi)變動(dòng).1.2.7coIP驗(yàn)證1.2.7.1Western Blot檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)分別以pPC86TRAF3和pDBLeuDaxx為模板，構(gòu)建pFLAGCMV2TRAF3, pFLAGCMV2TRAF3TRAF3和pCMVMycDaxx載體. 將HepG2細(xì)胞

11、接種到24孔板中，待生長(zhǎng)至8090%融合時(shí)，利用Invitrogen公司的LipofectamineTM 2000將pFLAGCMV2TRAF3, pFLAGCMV2TRAF3TRAF, pCMVMycDaxx分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞. 轉(zhuǎn)染46 h為細(xì)胞換含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育36 h后裂解細(xì)胞，提取蛋白，具體操作方法見(jiàn)PIERCE公司的哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū). 所提蛋白經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，分別加入一抗（鼠的FLAG和myc抗體）、二抗（辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG），檢測(cè)FLAGTRAF3, FLAGTRAF3TRAF, mycDaxx融合蛋白的表達(dá)

12、.1.2.7.2免疫共沉淀和Western Blot驗(yàn)證將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞. 兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組：pFLAGCMV2TRAF3和pCMVMycDaxx，pFLAGCMV2TRAF3TRAF和pCMVMycDaxx；對(duì)照組：pFLAGCMV2空載體和pCMVMycDaxx. 轉(zhuǎn)染36 h后提取蛋白. 具體操作方法見(jiàn)PIERCE公司的哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū). 取上清加入0.5 L兔IgG和10 L protein A agarose，4 轉(zhuǎn)鼓上2 h，離心取上清，加入myc抗體，4轉(zhuǎn)鼓上2 h，加入protein A agarose，4過(guò)夜. 離心，棄上清，用NET明膠緩沖液洗滌沉淀（具體操作見(jiàn)分子克隆第二版，免疫沉淀法）. 加入2×蛋白上樣緩沖液，99，5 min變性. 離心取上清，經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上,加入一抗（鼠FLAG抗體）、二抗（辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG），進(jìn)行immumobloting檢測(cè).2結(jié)果2.1成功構(gòu)建誘餌質(zhì)粒PCR鑒定見(jiàn)圖1. 測(cè)序結(jié)果表明pDBLeuDaxx載體構(gòu)建正確.圖1Daxx cDNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析圖略2.2文庫(kù)的篩選和三陽(yáng)性克隆的鑒定將所構(gòu)建好的pDBLeuDaxx轉(zhuǎn)化到酵母MaV