精品資料（2021-2022年收藏的）血液學(xué)及檢驗(yàn)試驗(yàn)教學(xué)筆記

1、血液學(xué)及檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)筆記實(shí)驗(yàn)十三 自溶+糾正、高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、Coombs試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一 自身溶血試驗(yàn)及其糾正試驗(yàn) autohemolysis test and correcting test【目的】 掌握自溶+糾正、高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、Coombs試驗(yàn)的方法及結(jié)果判斷及臨床應(yīng)用。1. 原理：2. 器材和試劑：（1）無(wú)菌0.556mol/L（100g/l）葡萄糖液（2）無(wú)菌N.S（3）1g/l肝素水溶液（4）氰化高鐵Hb轉(zhuǎn)化液（5）無(wú)菌小瓶（5ml），內(nèi)加0.3ml肝素，50烘干滅菌（6）無(wú)菌注射器和吸管3. 步驟和方法（1）試管中加葡萄糖20mg，109mol/L枸櫞酸鈉液0.2ml，血

2、1.8ml。（2）125g離心5min，調(diào)血細(xì)胞血漿為1 1。（3）取抗凝血1ml，加亞硝酸鈉葡萄糖混合液和亞甲藍(lán)各0.5ml，混勻，37水浴3h。（4）取血0.1ml，加磷酸鹽緩沖液10ml，2min后，635nm比色得吸光度為SA。（5）用未加亞硝酸鈉葡萄糖血，做上步試驗(yàn)，得吸光度為B。l 540nm比色，計(jì)算。溶血率（%）=1 RBC比容未保溫全血管讀數(shù)×4×測(cè)定管讀數(shù)×100注：未保溫全血管稀釋100倍，測(cè)定管稀釋25倍，故乘以4。4. 臨床意義： 正常人：應(yīng)75%； 雜合子：多在7431%； 純合子：多30%。5. 注意事項(xiàng)：l RBC比積30%時(shí)，還原

3、率顯著下降，故需調(diào)整血細(xì)胞和血漿比。l 以ACD作抗凝劑時(shí)，其與血液之比為1：9，過(guò)量則pH下降。l 一般要求St比B大8倍以上。l 不穩(wěn)定Hb易被氧化造成假陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)二 高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)methemogobin reduction test MHb-RT1. 原理：亞硝酸鈉當(dāng)RBC內(nèi)G6PD含量正常時(shí)，由磷酸戊糖代謝途徑生成的NADPH可作為MHb的還原酶的輔酶，在美藍(lán)的參與下，MHb被還原成Hb。如G6PD缺乏，還原速度減慢，或不能還原。通過(guò)測(cè)定還原速度間接反應(yīng)G6PD的活性。Hb（Fe2+）Hb（Fe2+）MHb（Fe3+）美藍(lán)H+2. 器材與試劑（1）亞硝酸鈉和葡萄糖混合液（2）亞

4、甲藍(lán)（3）磷酸鹽緩沖液3 方法及計(jì)算：（1）試管中加葡萄糖20mg，109mol/L枸櫞酸鈉液0.2ml，血1.8ml。125g離心5min，調(diào)血細(xì)胞血漿為1 1。（2）取抗凝血1ml，加亞硝酸鈉葡萄糖混合液和亞甲藍(lán)各0.5ml，混勻，37水浴3h。（3）取血0.1ml，加磷酸鹽緩沖液10ml，2min后，635nm比色得吸光度為SA。（4）用未加亞硝酸鈉葡萄糖血，做上步試驗(yàn)，得吸光度為B。4. 參考值： 正常人：應(yīng)75%；雜合子：多在7431%純合子：多30%。5.注意事項(xiàng)：l RBC比積30%時(shí)，還原率顯著下降，故需調(diào)整血細(xì)胞和血漿比。l 以ACD作抗凝劑時(shí)，其與血液之比為1：9，過(guò)量則p

5、H下降。l 一般要求St比B大8倍以上。l 不穩(wěn)定Hb易被氧化造成假陽(yáng)性。3. 臨床意義：設(shè)問(wèn)實(shí)驗(yàn)三 抗人球蛋白試驗(yàn)Coombs test重點(diǎn)1 原理：不完全抗體（IgG）在鹽水介質(zhì)中不能使RBC凝集，只附著在RBC上（致敏RBC），此種抗體是人類球蛋白，如果用家兔抗人球蛋白加入，可使致敏RBC發(fā)生凝集。用于檢測(cè)體內(nèi)不完全抗體的試驗(yàn)。有間接和直接試驗(yàn)兩種。2 方法與步驟間接抗人球蛋白試驗(yàn)：檢查血清中的不完全抗體D-RBC待檢血清致敏RBC抗人球蛋白R(shí)BC凝集管號(hào)PDd待測(cè)患者血清2滴  10%OD-RBC1滴1滴 抗D血清 1滴1滴10%Od-RBC&#

6、160; 1滴混勻，37水育1h，810倍生理鹽水洗滌3次以上，留壓積RBC，加抗人球蛋白血清1滴，轉(zhuǎn)動(dòng)試管混勻，觀察結(jié)果。P管凝集：血清中含有不完全抗體。如檢查孕婦血清中有無(wú)不完全抗體。直接抗人球蛋白試驗(yàn)：檢查RBC上的不完全抗體臨床意義：C上含有不完全抗體。如檢測(cè)新生兒臍血RBC上有無(wú)來(lái)自母體的抗體。實(shí)驗(yàn)小結(jié)：實(shí)驗(yàn)十四 血小板功能試驗(yàn)，PF3aT試驗(yàn)檢測(cè)一、血小板粘附試驗(yàn)（platelet adhension test，PAdT ）常用方法：玻球法、玻璃濾器法、玻柱法原理 BPL可粘附于帶負(fù)電荷的非生理性物質(zhì)表面如金屬、玻璃等血液在特制的玻球內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，BPL可粘附于玻璃球內(nèi)表面故血

7、液在玻球內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)后BPL數(shù)比較轉(zhuǎn)動(dòng)前后血液中BPL數(shù)可了解BPL粘附功能 。器材、試劑 玻球、轉(zhuǎn)動(dòng)裝置、顯微鏡、牛鮑計(jì)數(shù)板、枸櫞酸鹽抗凝劑、血小板稀釋液等。操作1 取血1.8ml0.2ml枸櫞酸加入玻球旋轉(zhuǎn)3rpm/min×15min2 計(jì)數(shù)粘附前后血小板數(shù)，算出粘附率。臨床意義1、PAdT增高：見(jiàn)于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病。2、PAdT減低：見(jiàn)于血管性血友病、巨大BPL綜合征、BPL無(wú)力癥、尿毒癥、異常蛋白血癥、 MDS、AL等。參考值 45.34%79.78%二、血小板聚集試驗(yàn)（platelet aggregation test ,PAgT）原理 器材、試劑 血液凝聚儀、血小板聚集誘

8、導(dǎo)劑：3.0mol/L腺苷二磷酸鈉鹽（ADP）、腎上腺素、膠原、瑞斯托霉素、花生四烯酸。臨床意義1、增高：反映血小板聚集功能增強(qiáng)。見(jiàn)于血栓前狀態(tài)和血栓性疾病。2、減低：反映血小板聚集功能減低。見(jiàn)于血小板無(wú)力癥、貯存池病、尿毒癥、肝硬化等。BPL聚集分析參數(shù)：2A、4A、MA、TMA、T50%、Dt三、血小板第3因子有效性檢測(cè)（platelet factor 3 acailability test ，PF3aT）原理 PF3是凝血的重要成分；當(dāng)PF3缺乏時(shí)復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)。本試驗(yàn)是利用正人和病人PRP血漿以及PPP血漿相互配合，以白陶土作為活化劑測(cè)定各組標(biāo)本的RT比較各組差異而了解PF3有否缺陷。組

9、別 病人血漿mL 正常人血漿mL 40%g/L白陶土懸液(mL) PRPPPPPRPPPP10.1  0.10.22 0.10.1 0.230.10.1  0.24  0.10.10.2操作 臨床意義超過(guò)5秒為PF3有效性減低見(jiàn)于：BPL第3因子缺陷癥、BPL無(wú)力癥、巨大BPL綜合征等。參考值 復(fù)鈣時(shí)間1組較2組延長(zhǎng)低于5秒四、實(shí)驗(yàn)小結(jié)：實(shí)驗(yàn)十五 PT、KPTT、SCT、因子篩選試驗(yàn)【目的】 掌握PT、KPTT、SCT、因子篩選試驗(yàn)的原理、方法及結(jié)果判斷。一、硅化的凝血時(shí)間測(cè)定（SCT）【原理】 由于本法采用硅化的

10、用品，硅管內(nèi)壁可以阻止接觸活化過(guò)程，故硅管法的凝血時(shí)間較普通試管法為長(zhǎng)。【器材】 8mm直徑玻璃試管（硅化管），滅菌注射器（硅化），水浴箱，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。【操作】1準(zhǔn)備試管 取8mm直徑的硅化玻璃試管3支，編號(hào)為1、2、3，置于37水浴箱中預(yù)溫3min。2采血并計(jì)時(shí) 常規(guī)靜脈采血3ml（自血液流入針頭，即開(kāi)始計(jì)時(shí)），去掉針頭后分別沿試管壁緩緩注入1ml血液于3支試管內(nèi)，置于37水浴中。3間隔計(jì)時(shí) 3min后每間隔0.5min，將第1支試管傾斜1次（傾斜30度），直至血液凝固。再觀察第2支試管，第2支試管血液凝固后再觀察第3支試管。第3支試管血液凝固時(shí)，立即停止計(jì)時(shí)。4計(jì)算 計(jì)算從血

11、液進(jìn)入針頭到第3支試管血液凝固所需要的時(shí)間，即凝血時(shí)間 ?！咀⒁馐马?xiàng)】 硅管法的注意事項(xiàng)與試管法相同。【參考值】 1532min。二、血漿凝血酶原時(shí)間測(cè)定（PT）【原理】 在受檢血漿中加入足量的凝血活酶和鈣離子，測(cè)定血漿凝固的時(shí)間，即為血漿凝血酶原時(shí)間（prothrombin time , PT）。本試驗(yàn)是外源性凝血系統(tǒng)常用的篩檢試驗(yàn)?！酒鞑摹?水浴箱，滅菌注射器，硅化試管或塑料管，離心機(jī)，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球?！驹噭?25mmol/L氯化鈣凝血活酶試劑。商品試劑，用前按要求用蒸餾水溶解混勻。2正常人凍干混合血漿。多為商品試劑，用25個(gè)以上正常人血液經(jīng)109mmol/L枸櫞酸鈉抗凝（血液

12、與抗凝劑之比為91），3000r/min離心10min，分離血漿后，混合分裝為每瓶1ml，凍干保存。3109mmol/L枸櫞酸鈉溶液。【操作】1采血并分離血漿 常規(guī)靜脈采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸櫞酸鈉溶液0.2ml的硅化試管或塑料管中，充分混勻，3000r/min離心10min，分離血漿。2平衡溫度 將氯化鈣凝血活酶溶液和正常人混合凍干血漿置室溫中15min。3預(yù)溫 將氯化鈣凝血活酶溶液和正常人混合凍干血漿、待測(cè)血漿，置37水浴中預(yù)溫5min。4測(cè)定 取小試1支，加入正常人混合凍干血漿0.1ml， 37水浴預(yù)溫30s，再加入預(yù)溫的25mmol/L氯化鈣凝血活酶溶液0.2ml，

13、混勻，立即啟動(dòng)秒表計(jì)時(shí)。5計(jì)時(shí) 不斷地輕輕傾斜試管，觀察試管內(nèi)液體的流動(dòng)情況，當(dāng)液體流動(dòng)緩慢趨于停止時(shí)，終止計(jì)時(shí)，并記錄所需時(shí)間。重復(fù)測(cè)定23次，取其平均值。6測(cè)定待測(cè)血漿 以同樣方法測(cè)定待測(cè)血漿的凝血酶原時(shí)間（重復(fù)23次測(cè)定，取其平均值）。7結(jié)果報(bào)告 以直接測(cè)定的時(shí)間（PT）報(bào)告，同時(shí)，報(bào)告正?；旌蟽龈裳獫{PT。以PT比值（PTR）報(bào)告，PTR=待測(cè)血漿PT/正常人混合凍干血漿PT。以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）報(bào)告，INR=PTRISI（ISI為氯化鈣凝血活酶試劑國(guó)際敏感指數(shù)）?！咀⒁馐马?xiàng)】1所用試管必須潔凈、干燥、無(wú)劃痕。2采血要順利，血液與抗凝劑比例（91）要準(zhǔn)確?？鼓浞?，充分混勻，決

14、不能有血凝塊。3采血后宜在1h內(nèi)完成測(cè)定，4冰箱內(nèi)保存不應(yīng)超過(guò)4h，20下可保存14d，70下可保存6個(gè)月。4先測(cè)定正常人混合凍干血漿的凝血酶原時(shí)間，其結(jié)果在正常允許范圍內(nèi)后才能測(cè)定待測(cè)血漿。5水浴溫度要控制在（37.0±0.5），溫度過(guò)高或過(guò)低都可影響測(cè)定結(jié)果。6血細(xì)胞比容（Hct）小于0.2或大于0.5時(shí)，抗凝劑的用量應(yīng)做調(diào)整?？鼓齽╩l）=（100Hct）×血液（ml）×0.00185。7由于每次使用的氯化鈣凝血活酶活性不盡相同，測(cè)定的條件也略變動(dòng)，故每次測(cè)定均需有正常對(duì)照。8氯化鈣凝血活酶必須注明國(guó)際敏感指數(shù)（ISI）?！緟⒖贾怠?PT：1113s（超過(guò)

15、正常對(duì)照3s有意義）。PTR：0.851.15。INR：0.81.5。三、活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定【原理】 在37條件下，以白陶土（激活劑）激活、因子，以腦磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第3因子，在Ca2參與下，測(cè)定血漿凝固所需的時(shí)間。本試驗(yàn)是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)靈敏和常用的篩檢試驗(yàn)?！酒鞑摹?水浴箱，滅菌注射器，硅化玻璃試管或塑料管，離心機(jī)，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球?！驹噭?109mmol/L枸櫞酸鈉溶液。2APTT試劑（含白陶土或鞣酸及腦磷脂） 液體試劑混勻后可直接使用，凍干試劑需用蒸餾水溶解再使用。325mmol/L氯化鈣溶液。4正常人混合凍干血漿 多為商品試劑，用25個(gè)以上正常人血漿經(jīng)10

16、9mmol/L枸櫞酸鈉溶液抗凝（血液與抗凝劑之比為91），3000r/min離心10min，分離血漿后，混合分裝為每瓶1ml，凍干保存?！静僮鳌?采血并分離血漿 常規(guī)靜脈采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸櫞酸鈉溶液0.2ml的硅化試管或塑料管中，充分混勻，3000r/min離心10min，分離血漿。2平衡溫度 用蒸餾水溶解正常人混合凍干血漿，于室溫下靜置15 min以上，充分混勻。3預(yù)溫活化 于試管中加入正常人凍干血漿和APTT試劑各0.1ml，混勻，37水浴中預(yù)溫3 min，預(yù)溫過(guò)程中，輕輕振搖數(shù)次。4加鈣計(jì)時(shí) 于試管中加入預(yù)溫至37的25mmol/L 氯化鈣溶液0.1ml，混勻，

17、并立即計(jì)時(shí)，置水浴中不斷振搖。20s后，不時(shí)地緩慢傾斜試管，觀察試管內(nèi)液體的流動(dòng)狀態(tài)，當(dāng)液體停止流動(dòng)時(shí)停止計(jì)時(shí)，記錄時(shí)間，重復(fù)檢測(cè)23次，取平均值。5測(cè)定待測(cè)血漿 以同樣方法測(cè)定待檢血漿的APTT（重復(fù)測(cè)定23次，取平均值）?！咀⒁馐马?xiàng)】1采血要順利，血液與抗凝劑要充分混勻。2采血后應(yīng)盡快檢測(cè)，最遲不應(yīng)超過(guò)2h。被檢血漿放置過(guò)久，凝固時(shí)間有縮短的傾向。3血漿加APTT試劑后預(yù)溫時(shí)間不得少于3min。4血液離心速度要達(dá)到3 000r/min，時(shí)間為10min，以便盡可能除去血小板。5活化劑因規(guī)格不一，其致活能力不同，因此參考值有差異。如果正常人混合凍干血漿APTT明顯延長(zhǎng)，則提示APTT試劑質(zhì)量不佳。6檢測(cè)前應(yīng)先測(cè)定正常人混合血漿，如果其APTT在允許范圍內(nèi)方能測(cè)定待檢標(biāo)本。否則，應(yīng)重新配制APTT試劑?！緟⒖贾怠?25.0735.00s，超過(guò)正常對(duì)照