太子?、蚣鍎οＰ碗嗍笫人嵝粤＜毎皟?nèi)皮素1的影響

1、太子健煎劑對哮喘模型豚鼠嗜酸性粒細胞及內(nèi)皮素1的影響B(tài)eg from beggers and youll never be rich. One cannot be in two place at once. 【摘要】目的觀察太子健煎劑對哮喘模型豚鼠支氣管壁內(nèi)的嗜酸性粒細胞(EOS)及內(nèi)皮素1(ET1)的影響，探討太子健煎劑抗小兒哮喘復(fù)發(fā)的作用機制。方法將50只豚鼠隨機分為5組，正常對照組、哮喘模型組、地塞米松組、高、低劑量太子健煎劑組，卵白蛋白致敏并成功誘喘，分別灌服生理鹽水、地塞米松、高、低劑量太子健煎劑，連續(xù)15d。用計數(shù)板計數(shù)豚鼠血、支氣管肺泡灌洗液(BALF)、支氣管壁內(nèi)的EOS數(shù)，放

2、免法檢測BALF中ET1含量。結(jié)果與哮喘模型組比較，太子健煎劑高劑量組能減少BALF及支氣管壁內(nèi)EOS的數(shù)量(P0.05)，降低BALF中ET1的水平(P0.01)()。結(jié)論太子健煎劑可能通過減輕EOS浸潤、ET1產(chǎn)生，減輕氣道的慢性炎癥。 【關(guān)鍵詞】哮喘;太子健煎劑;豚鼠;動物，實驗;嗜酸細胞;內(nèi)皮素縮血管肽類【Abstract】ObjectiveToobservetheeffectofTaizijiandecoction(TZJ)onEOSandET1ofguineapigasthmamodels.ToexplorethemechanismofTZJonantirelapsingchild

3、renasthma.Methods50guineapigsweredividedinto5groupsrandomly，normalcontrolgroup，asthmamodelgroup，dexamethasonegroup，highdoseTZJgroupandlowdoseTZJgroup.Thefivegroupsweresensitizedwithovalbumin，andinducedasthmasuccessfully.Afterthateachgroupweregivendifferentpreventiveandtreatmentsfor15days.Thenthenumb

4、erofeosinophils(EOS)inperipheralblood，bronchoalveolarlavagefluid(BALF)andbronchialwallwerecountedbycountingplate.ThecontentofET1inBALFweremeasuredbyradioimmunitymethods.ResultsHighdoseTZJcouldreducethenumberofEOSinBALFandbronchialwall(P0.05)，lowertheET1contentinBALF(P0.01)comparedwithguineapigasthma

5、models.ConclusionTZJcanlessenEOSinfiltrationandregulateET1production，suggestingthatitmighttakeeffectinalleviatingthechronicairwayinflammation.【Keywords】Asthma;Taizijiandecoction;Guineapig;Animal,experiment;Eosinophils;Endothelin支氣管哮喘是小兒最常見的慢性疾病之一，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢。據(jù)2000年全國兒童哮喘防治協(xié)作組調(diào)查結(jié)果顯示1,國內(nèi)015歲

6、兒童哮喘患病率為1.97%，2年現(xiàn)患率為1.54%，較10年前上升了64.8%。哮喘反復(fù)發(fā)作，嚴重影響患兒的生長發(fā)育和身心健康。雖然小劑量激素長期吸入是目前抗復(fù)發(fā)的主要治療方法，但有報道顯示，長期吸入激素也可出現(xiàn)激素依賴和抑制免疫系統(tǒng)功能，進而誘發(fā)或加重感染,甚至影響小兒的生長發(fā)育2，3。 支氣管哮喘是一種有免疫功能紊亂的全身變態(tài)反應(yīng)性疾病。免疫分子生物學(xué)的深入研究發(fā)現(xiàn)，哮喘反復(fù)發(fā)作與氣道的慢性非特異性炎癥、氣道高反應(yīng)性、全身免疫及內(nèi)分泌功能紊亂等密切相關(guān)，多種免疫細胞、炎癥介質(zhì)及細胞因子參與了慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程4(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。因此哮喘是一種全身疾病，氣道炎癥僅僅是其中的一

7、種局部表現(xiàn)，吸入激素只注重了局部抗炎治療而疏忽了全身的調(diào)整。而中醫(yī)中藥在小兒哮喘抗復(fù)發(fā)的治療中，通過改善患兒的體質(zhì)，調(diào)節(jié)其免疫功能，發(fā)揮整體治療的優(yōu)勢，從而達到防治哮喘復(fù)發(fā)的目的，具有減少復(fù)發(fā)、改善臨床癥狀快、毒副反應(yīng)少等優(yōu)點。俞景茂教授在長期的臨床實踐中，根據(jù)小兒的生理病理特點，運用“和法”，采用經(jīng)驗方太子健方，抗小兒哮喘復(fù)發(fā)具有顯著療效。本實驗旨在探討該方防治哮喘復(fù)發(fā)的可能機制。 1材料與方法 1.1實驗動物健康DHP幼年豚鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量(23534)g。由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，動物合格證號：浙醫(yī)動字20000710。1.2試劑與藥品(1)內(nèi)皮素1(ET1)放免試劑盒

8、(北京東雅生物技術(shù)研究所，批號：20001101);(2)太子健煎劑：太子健方中藥物(柴胡、黃芩、法半夏、丹參、太子參、菟絲子、象貝、蟬衣、炙甘草、紅棗等)均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供。藥汁濃縮成生藥2g/mL和1g/mL兩種濃度，分裝入已消毒的瓶中，密封后再高溫滅菌，置冰箱保存?zhèn)溆?(3)地塞米松磷酸鈉注射液1mL：5mg/支(江蘇方強制藥廠，批號：991024)。以生理鹽水配成0.2g/L溶液備用;(4)卵蛋白片：由上?；瘜W(xué)試劑站提供，批號F981130。Good counsel never comes too late. 1.3實驗儀器(1)402超聲霧化器(上海四菱醫(yī)療器械

9、廠);(2)SN695型智能放免測量儀(上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠)。1.4實驗方法1.4.1動物分組將豚鼠按隨機數(shù)字表法分成5組，正常對照組、哮喘模型組、太子健煎劑高劑量組、太子健煎劑低劑量組和地塞米松組，每組各10只。1.4.2動物模型的制備參照文獻5，75%乙醇溶液消毒局部皮膚后，給哮喘模型組、太子健煎劑高、低劑量組及地塞米松組每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水溶液1mL致敏，第15天將致敏豚鼠置于4L的玻璃鐘罩內(nèi)，給予超聲霧化吸入1%卵蛋白生理鹽水溶液激發(fā)，每次霧化15s，并在霧室中放置至哮喘發(fā)作，即為造模成功。隔天霧化1次，共5次。如豚鼠出現(xiàn)抽搐，馬上將其取出，必要時做人工呼吸，

10、防止豚鼠死亡。正常對照組用生理鹽水1mL代替抗原液腹腔注射，第15天起隔天予超聲霧化吸入等容積的生理鹽水。1.4.3干預(yù)方法致敏第8天起，正常對照組及哮喘模型組予生理鹽水2mL灌胃，太子健煎劑高劑量組按生藥20g/(kgd)(10mL/(kgd)，200%太子健無菌溶液)灌胃，太子健煎劑低劑量組按生藥10g/(kgd)(10mL/(kgd)，100%太子健無菌溶液)灌胃，地塞米松組給予地塞米松1mg/(kgd)灌胃。每日1次，連續(xù)給藥15d。The farmers are the founders of civilization and prosperity. 1.5觀測指標(biāo)A man can

11、not whistle and drink at he same time. 1.5.1血液及支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞(EOS)計數(shù)末次抗原激發(fā)后，以2%戊巴比妥鈉50mg/kg的劑量腹腔注射麻醉豚鼠，摘眼球取血5mL后，剪開胸腔，分離出氣管，剪開氣管，用適宜的導(dǎo)管經(jīng)氣管插管并結(jié)扎固定，緩慢向?qū)Ч軆?nèi)注入無菌生理鹽水7mL，保留30s后輕輕回抽，反復(fù)灌洗3次，將所得的BALF定量后離心(1500r/min，離心10min)，收集上清液，置-70低溫冰箱中保存。取乙醇伊紅稀釋液0.38mL于小試管內(nèi)，分別加入血及BALF20L，立即輕輕混合均勻，充分混勻充入雙側(cè)計數(shù)池內(nèi)，靜置25

12、min。低倍鏡下計數(shù)10個大方格(兩側(cè)計數(shù)池的中央和四角的大方格)內(nèi)EOS數(shù)，再根據(jù)公式：10個大方格內(nèi)EOS數(shù)20，求出每微升EOS數(shù)。1.5.2BALF中ET1的檢測取離心后的BALF上清液，采用放射免疫分析法測定ET1。具體操作均嚴格按試劑盒說明書進行。Everybodys business is nobodys business. 1.5.3肺組織EOS浸潤程度剪取每只豚鼠左肺下葉組織，浸泡于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，HE染色。光鏡下觀察支氣管、肺泡等組織形態(tài)變化及EOS等炎性細胞的浸潤程度。并參照文獻6，高倍鏡下，隨機選取5個支氣管，數(shù)支氣管壁內(nèi)的EOS個數(shù)(不包

13、括管腔內(nèi)及管周的EOS)，以支氣管壁的周長為單位(細胞個數(shù)/100m)計數(shù)EOS數(shù)量，然后求其平均數(shù)。1.6統(tǒng)計學(xué)方法計量資料以s表示。多組間均數(shù)比較采用方差分析，以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。2結(jié)果Joy put heart into a man. 2.1太子健煎劑對哮喘豚鼠一般情況的影響豚鼠誘喘后普遍出現(xiàn)精神較差，拱背群聚，反應(yīng)遲鈍，活動及飲食減少等表現(xiàn)，而太子健煎劑觀察組較其他兩組恢復(fù)快。第1次及第4次誘喘時，哮喘模型組有2只豚鼠，太子健煎劑低劑量組有1只豚鼠誘喘后哮喘嚴重發(fā)作而死亡。論文教育信息網(wǎng) 2.2太子健煎劑對BALF中ET1的影響見表

14、1。表1太子健煎劑對BALF中ET1的影響注：與正常對照組比較，aP0.05，bP0.001;與哮喘模型組比較，cP0.01，dP0.001;與地塞米松組比較，eP0.05。表1結(jié)果表明：哮喘時ET1明顯升高;地塞米松能明顯抑制ET1的升高;太子健煎劑高劑量組、太子健煎劑低劑量組均能抑制ET1升高，但作用較地塞米松組弱。2.3太子健煎劑對哮喘豚鼠血液、BALF及支氣管壁內(nèi)EOS數(shù)的影響見表2。表2太子健煎劑對哮喘豚鼠血液、BALF及支氣管壁內(nèi)EOS數(shù)的影響注：與正常對照組比較，aP0.001;與哮喘模型組比較，bP0.05，cP0.01，dP0.001;與地塞米松組比較，eP0.05，fP0.

15、01。If they say you are good, ask yourself if it be ture. 表2說明過敏性哮喘時，無論在外周血中還是局部氣道內(nèi)EOS均明顯增加;地塞米松能顯著降低EOS;太子健煎劑高劑量組能顯著降低氣道局部的EOS量;太子健煎劑低劑量組對EOS作用不明顯。3討論哮喘是氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥，其基本病理生理變化是EOS的浸潤，EOS尤其是低密度嗜酸性粒細胞是氣道炎癥中的主要效應(yīng)細胞，與晚期哮喘反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性關(guān)系密切。EOS被激活可產(chǎn)生白三烯和血小板活化因子等炎性介質(zhì)，還可引起肥大細胞釋放組胺和趨化因子，并建立自身維持環(huán)，吸引更多EOS聚集到反應(yīng)部位，從而

16、形成一種周而復(fù)始的持續(xù)炎癥反應(yīng)，并進一步釋放主要堿基蛋白、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、血小板活化因子和緩激肽，對上皮細胞發(fā)生毒性作用，導(dǎo)致上皮損傷、支氣管痙攣、黏液分泌增多，且EOS在哮喘緩解期仍處于高水平7。本實驗結(jié)果表明，太子健煎劑能顯著降低氣道局部的EOS數(shù)，直接抑制EOS在氣道內(nèi)的浸潤，減輕了EOS所釋放的毒性蛋白對氣道上皮和肺組織的損傷，從而減輕氣道的慢性炎癥及降低氣道的高反應(yīng)性。ET，尤其是ET1，是哮喘發(fā)病過程中的重要炎性介質(zhì)。ET1不僅加劇平滑肌的收縮，還提高了氣道平滑肌自身收縮反應(yīng)性，并導(dǎo)致因氣道細胞異常增殖引起的氣道重建。它能增加血管通透性，促進炎癥細胞向氣道內(nèi)聚集，損傷氣道上

17、皮細胞，在氣道局部形成惡性循環(huán)，促進了氣道高反應(yīng)性。目前認為這種機制可能是造成慢性頑固性哮喘難以控制的重要原因4。本實驗結(jié)果表明太子健煎劑能抑制ET1升高，從而減輕ET1對氣道的損傷及支氣管痙攣，改善氣道的通氣功能。Nightingales will not sing in a cage. 小兒哮喘反復(fù)發(fā)作的誘因以感冒居多，大部分哮喘患兒往往又是復(fù)感兒，臨床常因感冒而出現(xiàn)哮鳴、痰喘、咳嗽等癥狀。病情時緩時著，時發(fā)時止，似有往來不已之勢。俞景茂教授認為哮喘緩解期表現(xiàn)為正虛而表未盡，病機為樞機失利，病在少陽，兼及太陽，又由于小兒具有易虛易實、易寒易熱的病理特點，不宜峻補，故擬太子健方采用“和法”緩

18、調(diào)。太子健方(由柴胡、黃芩、法半夏、丹參、太子參、菟絲子、象貝、蟬衣、炙甘草、紅棗等組成)，從小柴胡湯化裁而來。現(xiàn)代藥理研究證實：小柴胡湯具有抗炎、增強免疫、抑制變態(tài)反應(yīng)、促腎上腺皮質(zhì)激素分泌、抑制血小板凝集等作用8。中醫(yī)認為痰瘀互結(jié)是哮喘反復(fù)發(fā)作的宿根，風(fēng)邪引動是外因，故加入象貝化痰、丹參活血、蟬衣散風(fēng)。實驗研究證實9，丹參能改善哮喘患者長期缺氧造成的微循環(huán)障礙，能抗過敏，穩(wěn)定肥大細胞膜，抑制其脫顆粒和介質(zhì)釋放，抑制漿細胞產(chǎn)生IgE，提高機體IgG及補體C3等作用。哮喘患兒還存在一定程度的腎上腺皮質(zhì)功能不足，故加入菟絲子溫腎助陽，提高皮質(zhì)激素的水平。全方消補兼施，寒溫并用，表里同治，恰合小兒

19、“易寒易熱、易虛易實”的病理特點。通過活血化痰消除氣道慢性炎癥，理氣降低氣道高反應(yīng)性，補虛調(diào)整機體的免疫功能，祛風(fēng)抗過敏，風(fēng)、氣、痰、瘀、虛兼顧，發(fā)揮整體調(diào)節(jié)的效應(yīng)，達到抗哮喘復(fù)發(fā)的目的。因此，臨床運用“和法”抗小兒哮喘復(fù)發(fā)符合小兒哮喘的發(fā)病機制及小兒的生理病理特點，是本病緩解期的基本治則。There is more trouble in having nothing to do than in having much to do. 本實驗主要從抗氣道慢性炎癥等方面初步探索了太子健煎劑的作用機制。今后仍應(yīng)需在免疫功能調(diào)節(jié)、抗感染、抗病毒等方面進行更深入的研究。【參考文獻】1全國兒童哮喘防治協(xié)作組.中國城區(qū)兒童哮喘患病率調(diào)查J.中華兒科雜志,2003,41(2