大鼠卵巢過度刺激綜合征模型與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素-6的

1、大鼠卵巢過度刺激綜合征模型與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素-6的         【摘要】 目的觀察大鼠卵巢過度刺激綜合征(OHSS)模型中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的變化,探討其與OHSS的相關(guān)性，為臨床上進(jìn)一步治療開拓新的途徑。方法將未成年雌性Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組。實(shí)驗(yàn)組皮下注射孕馬血清促性腺激素(        【摘要】  目的觀察大鼠卵巢過度刺激綜合征(OHSS

2、)模型中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的變化,探討其與OHSS的相關(guān)性，為臨床上進(jìn)一步治療開拓新的途徑。方法將未成年雌性Wistar大鼠20只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩組。實(shí)驗(yàn)組皮下注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)制成OHSS模型；對(duì)照組皮下注射等量生理鹽水。用ELISA法檢測(cè)血中VEGF和IL-6的含量,采用免疫組化方法觀察大鼠卵巢黃體和子宮VEGF和IL-6的表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組卵巢黃體中VEGF和IL-6明顯表達(dá),較對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異，血清中VEGF和IL-6含量明顯高于對(duì)照組，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異（P0.05)。結(jié)論VE

3、GF和IL-6與OHSS具有密切關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  卵巢過度刺激綜合征 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 白細(xì)胞介素-6 免疫組化 相關(guān)性研究卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome,OHSS)是臨床上誘發(fā)超排卵過程中較常見的醫(yī)源性并發(fā)癥，嚴(yán)重者可引起胸腹水、血液濃縮、血栓形成、肝腎功能衰竭甚至死亡。其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是毛細(xì)血管通透性增加，與卵巢過度分泌和產(chǎn)生血管活性物質(zhì)有關(guān)。其中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular edothelial growth factor,VEGF)是一種強(qiáng)烈的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,在此過程中發(fā)揮重要作用。它具

4、有促進(jìn)血管內(nèi)皮增生、遷移及增加血管通透性和加速新血管形成的作用,目前已經(jīng)在多數(shù)種屬包括大鼠的卵巢中發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過建立大鼠OHSS模型，觀察VEGF和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的改變，探討其與OHSS的相關(guān)性，為臨床進(jìn)一步治療奠定實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。1  器材與方法1.1  動(dòng)物與分組選用體重4550 g，鼠齡22 d的未成年Wistar雌鼠（清潔級(jí)）20只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組兩組。1.2  試劑與儀器一抗VEGF和IL-6兔抗IgG多克隆抗體、購(gòu)于santa cruze 公司，SP90

5、01試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司。LEICA RM2125石蠟切片機(jī)（萊卡上海分公司），Nikon尼康光鏡顯微照相機(jī)（日本株式會(huì)社尼康），Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司）。1.3  OHSS大鼠模型的建立按改良的Ujioka方法1在未成年鼠體內(nèi)建立OHSS模型。每只大鼠從第22日齡起連續(xù)4 d皮下注射含有10 妊娠雌馬血清促性腺激素(pregnancy mare serum go nadotropin,PMSG,天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心)的生理鹽水0.2 ml,第5天(最后一次注射PMSG后24 )注射含有100 IU HCG(麗珠制藥

6、廠)的生理鹽水0.2 。48 后卵巢顯著增大,表面紫褐色,有多個(gè)卵泡形成,出現(xiàn)腹水表明建立了大鼠模型。對(duì)照組同期皮下注射等量生理鹽水。1.4  標(biāo)本采集和貯存HCG注射72 h后即29 d齡時(shí)，肌肉注射氯氨酮（0.1 mg/kg）麻醉大鼠，尾靜脈注射1%的Evans Blue(EB,Sigma)0.1 ml。30 min后從大鼠眼眶采血1 ml入抗凝管，離心（3 000 r/min，10 min）取血漿-20保存?zhèn)錂z。另采血1 ml于試管中，待血液標(biāo)本凝固后，離心（3 000 r/min，10 min）吸取血清-20保存?zhèn)錂z。脫頸處死大鼠。正中切開腹腔，觀察有無(wú)腹水,然后按照Ujio

7、ka2和Khanna3的改良方法用5 ml生理鹽水沖洗腹腔。將沖洗液收集到試管中,稀釋至10 ml,加0.1 mol/L氫氧化鈉0.05 ml過濾,并以3 000 r/min的速度在室溫下離心10 min。然后用分光光度計(jì)(國(guó)產(chǎn)721型)在波長(zhǎng)590 nm測(cè)定OD值。隨后取出雙側(cè)卵巢組織，用生理鹽水清洗干凈。用4%多聚甲醛固定24 后,常規(guī)石蠟包埋,57 連續(xù)切片,用于免疫組化染色。1.5  觀察指標(biāo)1.5.1  腹腔毛細(xì)血管通透性根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度及其OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,算出腹腔沖洗液EB的含量。1.5.2  EGF和IL-6蛋白質(zhì)水平測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（EL

8、ISA）。大鼠外周血清VEGF測(cè)定定量試劑盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，靈敏度為3 pg/ml，板內(nèi)板間變異系數(shù)均<9.5%。血漿IL-6定量試劑盒購(gòu)自上海雄森科技實(shí)業(yè)有限公司,檢測(cè)方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。每個(gè)樣品均設(shè)2個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次試驗(yàn),結(jié)果用MK2型酶標(biāo)儀讀取吸光值，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線求相應(yīng)值（pg/ml）。1.5.3  VEGF和IL-6蛋白質(zhì)免疫組化染色采用SP法。一抗VEGF和IL-6兔抗IgG多克隆抗體購(gòu)于santa cruze 公司，SP9001試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司，具體操作過程按說(shuō)明書進(jìn)行,顯色,蘇木素復(fù)染。每組試驗(yàn)重復(fù)至少3次。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。1.5.4  免疫組化結(jié)果判斷光鏡下觀察和圖像分析,VEGF定位于黃體細(xì)胞,胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。Il-6在卵巢和子宮內(nèi)膜均有表達(dá)。選用同批染色切片,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野(200×), Nikon尼康光鏡顯微照相機(jī)采樣，圖像掃存后Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)測(cè)定平均光密度進(jìn)行分析。1.6  卵巢過度刺激綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)