PMSF及常用試劑的配制方法

1、英文全稱： Phenylmethanesulfonylfluoride 中文名稱：苯甲基磺酰氟 分子式： C7H7FO2S分子量： 174.19CAS 號(hào)： 329-98-6PubChem號(hào)：4784結(jié)構(gòu)示意圖：分類：OrganicChemicalsSulfurCompoundsSulfonesPhenylmethylsulfonylFluoride使用介紹：10mg/ml 溶于異丙醇（或無水乙醇）中；在室溫可保存一年 ,一般保存在 -20 度或 4 度 .；工作濃度：17174ug/ml （0.11mM），儲(chǔ)存液濃度為100或200mM; 在水液體溶液中不穩(wěn)定， 30分鐘就會(huì)降解一半，必須在

2、每一分離和純化步驟1）抑制絲氨酸蛋白酶 （如胰蛋白酶， 胰凝乳蛋白酶， 凝血酶）和巰基蛋白酶 （如 木瓜蛋白酶）；2）3）4）5）中加入新鮮的PMSF,樣品處理超過1h,補(bǔ)加一次。（見水分解，使用前加入） 【注意事項(xiàng)】1. PMSF劇毒，嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收 后有致命危險(xiǎn)。 為了安全和健康， 請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 一旦眼睛或 皮膚接觸了 PMSF,應(yīng)立即用大量水沖洗之。凡被 PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄。2. PMSF在水溶液中不穩(wěn)定。應(yīng)在使用前從貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于裂解緩沖液中。3. PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH值的升高而加快，且25C的失

3、活速率 高于4C。pH值為8.0時(shí)，20卩mmol/lPMSF水溶液的半壽期大約為 85min，這 表明將PMSF溶液調(diào)節(jié) 為堿性（PH8.6）并在室溫放置數(shù)小時(shí)后，可安全地予 以丟棄。PMSF的儲(chǔ)存：28C可以存放數(shù)月之久。欲長期保存，可凍存在 -20C例:100 mMPMSF稱量0.174gPMSF（針狀結(jié)晶固體）溶于10ml異丙醇，震蕩混勻，保存在-20度或4度. 工作濃度我一般用 1mM,1:100（V/V）加入即可.樣品處理超過1h,補(bǔ)加一次.（PMSF劇毒，為了安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作.PMSR嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)。一

4、旦眼睛或皮膚接觸了PMSF應(yīng)立即用大量水沖洗之。）PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨 pH值的升高而加快，且 25C的失活速率高于 4C。pH 值為8.0時(shí)，20卩mmol/lPMSF水溶液的半壽期大約為 85min，這表明將PMSF溶液調(diào)節(jié) 為堿性（pH8.6）并在室溫放置數(shù)小時(shí)后，可安全地予以丟棄。用異丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml （10mmol/L），分裝成小份貯存于-20C。女口 有必要可配成濃度高達(dá)17.4mg/ml的貯存液（100mmol/L ）。常用試劑的配制：1、30%丙烯酰胺(1)配制方法：將29G丙烯酰胺和1gN , N-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為 60ml 的水中

5、，加熱至37r溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml,用Nalgene濾器(0.45um 孔徑)過濾除菌，查證該溶液的 pH 值應(yīng)不大于 7.0，置之不理棕色瓶中保存于 室溫。( 2)說明：小心丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，其作用具螺 積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具。 可認(rèn)為聚丙烯酰胺無 毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料。一些價(jià)格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子， 在丙烯酰胺貯存 液中加入大約 0.2體積的單床混合樹脂( MB-1Mallinckrodt )，攪拌過夜，然后 用 Whatman1 號(hào)濾紙以純化之。 在貯存期間， 丙

6、烯酰胺和雙丙烯酰胺會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化 成丙烯酸和雙丙烯酸。2、10%過濾酸銨(1)配制方法：把1g過硫酸銨溶解于終量為10ml的水溶液中，該溶液可在4C 保存數(shù)周。3、1mol/L 氯化鈣(1) 配制方法：在20ml純水中(Milli-Ce水或相當(dāng)級(jí)別的水)溶解54gCacl2?6H2O 用0.22um濾器過濾除菌，分裝成10ml小份貯存于-20Co(2) 說明：制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，取出一小份解凍并用純水稀釋至100ml，用 Nalgene濾器(0.45um孔徑)過濾除菌，然后聚冷至 0Co4、1mol/L 二硫蘇糖醇( DTT )(1) 配制方法：用20ml0.01mol/L乙酸鈉溶液(pH5.2)溶

7、解3.09gDTT,過濾 除菌后分裝成 1ml 小份貯存于-20 C o(2) 說明：DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。5、0.5mol/LEDTA (pH8.0)(1) 配制方法：在800ml水中加入186.19=水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?2H2O)，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至 8.0 (約需20gNaoh顆粒)然后定容至1L,分裝后高壓滅菌備用。(2) 說明：EDTA二鈉鹽需加入NaoH將溶液的pH值調(diào)至接近8.0時(shí)，才能完 全溶解?；氐巾撌?、10mg/ml 溴化乙錠(1) 配制方法：在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全

8、 溶解，然后用鋁箔包裹容光煥發(fā)器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。(2) 說明：小心：溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶液時(shí)務(wù)必戴上手套，稱量染料時(shí)要戴面罩。這些溶液使用后應(yīng)按附錄E提供的方法之一進(jìn)行凈化處理。7、100mmol/LIPTG配制方法：IPTG為異丙基硫式-P -D-半乳糖苷(分子量為238.3D)，在8ml蒸 餾水中溶解2gIPTG后，用蒸餾水定容至10ml，用0.22um濾器過濾除菌，分裝 成 1ml 小份貯存于 -20Co8、1mol/L 硫酸酶(1)配制方法：在800ml水中溶解214.46g四水乙酸鎂，用水定容至1L,過濾 殺菌。9、p巰基乙醇(BME )

9、(1)配制方法：一般得到的是 14.4mol/L 溶液，應(yīng)裝在棕色瓶中保存于 4C；( 2)說明： BME 或含有 BME 的溶液不能高壓處理10、酚 /氯仿(1)配制方法：一般得到的是14.4mol/LTris?CI (pH7.6)抽提幾次以平衡這一 混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆蓋等體積的0.01mol/LTris?Cl (pH7.6)液層， 保存于 4C。( 2)說明：小心，酚腐蝕性很強(qiáng)，并可引起嚴(yán)重灼傷，操作時(shí)應(yīng)戴手套及防護(hù) 鏡，穿防護(hù)服。 所有操作均應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥中進(jìn)行。 與酚接觸過的皮膚部位應(yīng)用 大量的水清洗，并用肥皂和水洗滌，忌用乙醇。11 、 10mmol/L 苯甲基磺酰氟(

10、PMSF)(1) 配制方法：用異丙醇溶解 PMSF成1.74mg/ml (10mmol/L)，分裝成小份 貯存于-20C，如有必要可配成濃度高達(dá) 17.4mg/ml的貯存液(100mmol/L )。(2) 說明：小心：PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸和，吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)。一旦眼睛或皮膚接觸3PMSF,應(yīng)立即用大量水沖洗PMSF在水溶液中的活性喪失速率高于 4C。之。凡被 PMSF 污染的衣服應(yīng)予丟棄。 PMSF 在水溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)在使用前從 貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)加入裂解緩沖液中。pH值為8.0時(shí)，20umol/L的PMSF溶液的半壽期大約為 35分鐘(James, 1978

11、)， 這表明將PMSF溶液調(diào)節(jié)為堿性(PH8.6)并在室溫放置數(shù)小時(shí)后，可安全地予 以丟棄?；氐巾撌?2、磷酸鹽緩沖溶液( PBS)(1)配制方法：在800ml蒸餾水中溶解8gNacl、0.2gKcl、1.44gNa2HPO4和 0.24gKH2PO4,用HCL調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4加水定容至IL,在1516f/in2( 1.034 X 105Ps)高壓下蒸汽滅菌20分鐘，保存于室溫。13、乙酸鉀溶液(用于堿裂解)(1)配制方法：在 60ml5mol/L 乙酸鉀溶液中加入 11.5ml 冰乙酸和 28.5ml 水， 即成鉀濃度為3mol/L，而乙酸根濃度為5mol/L的溶液。14、3mol/

12、L 乙酸鈉(1)配制方法：在800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調(diào)節(jié) pH值至 5.2或同稀乙烯調(diào)節(jié)pH值至7.0,加水定容到1L,分裝后高壓滅菌。15、5mol/L 氯化鈉(1)配制方法：在800ml水中溶解292.2gNacl加水定容至1L ,分裝后高壓滅菌。16、 10%十二烷基硫酸鈉( SDS)(1) 配制方法：在900ml水中溶解100g電泳級(jí)SDS，加熱至68C助溶，加入 幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2,加水定容至1L，分裝備用。(2) 說明：SDS的微細(xì)晶粒易于擴(kuò)散，因此稱量時(shí)要戴口罩，稱量完畢后要清 除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的 SDS，10%SDS溶液無須滅

13、菌?；氐巾撌?7、20 X SSC(1)配制方法：在800ml水中溶解175.3gNacl和88.2g檸檬酸鈉，加入數(shù)滴10mol/LNach溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0加水定量至1L,分裝后高壓滅菌。18、100%三氯乙酸(1)配制方法：在裝有500gTCA的瓶中加入227ml水，形成的溶液含有100% (W/V) TCA。19、1mol/LTris(1)配制方法：在800ml水中溶解121.1gTris堿，加入濃HCL調(diào)節(jié)pH值至所 需值。)HHCL7.470ml7.6?60ml8.0?42ml應(yīng)使溶液冷至室溫后方可最后調(diào)定 pH值，加水定容至1L，分裝后高壓滅菌。(2)說明：如1mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，應(yīng)予丟棄，并置備質(zhì)量更好的Tris。盡管多種類型的電級(jí)均不能準(zhǔn)確測量 Tris溶液的pH值，但仍可向大多數(shù)廠商購得適 合的電極。Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高 C, pH值大約降低.03 個(gè)單位。例如：0.05mol/L的溶液在5C、25C和37C時(shí)的pH值分別為9.5、8.9 和 8.6。20、Tris緩沖液溶液(1)配制方法：在800ml蒸餾水中溶解8gNacl、0.2Kcl和3gTris堿，加入0.0