葶藶生脈飲對壓力負(fù)荷大鼠心肌組織MMP9及TIMP1表達(dá)的影響

1、葶藶生脈飲對壓力負(fù)荷大鼠心肌組織MMP9及TIMP1表達(dá)的影響                           作者：趙淑明 郭秋紅 張志良 吳迪 周樺 張一昕 【摘要】  目的 觀察葶藶生脈飲對壓力負(fù)荷增加致充血性心力衰竭(CHF)大鼠心肌組織基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP1)表達(dá)的影

2、響。方法 建立腹主動(dòng)脈縮窄所致充血性心力衰竭大鼠模型，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、葶藶生脈飲高劑量組、葶藶生脈飲低劑量組、陽性藥(心寶丸)對照組。使用MS4000 U生物信號定量記錄分析系統(tǒng)檢測各組大鼠的LVSP、LVEDP、±dp/dtmax變化;采用免疫組化法觀察各組大鼠心肌組織MMP9、TIMP1的表達(dá)情況。結(jié)果 模型組大鼠LVEDP、dp/dtmax升高，MMP9表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01);LVSP、+dp/dtmax降低，TIMP1表達(dá)減弱(P<0.05或P<0.01)。各給藥組與模型組比較， LVEDP、dp/dtmax降低，MMP9表達(dá)

3、減弱(P<0.05或P<0.01);LVSP、+dp/dtmax升高，TIMP1表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01);其中高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組和心寶組(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 葶藶生脈通過調(diào)控MMP9和TIMP1的表達(dá)，可能是其逆轉(zhuǎn)心室重塑、增強(qiáng)心臟功能、治療CHF的作用機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】  葶藶生脈飲;心力衰竭; MMP9; TIMP1【Abstract】 Objective To observe the effects of Tinglishengmaiyin on the expressions of matrix me

4、talloproteinases9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMP1) in the myocardiac tissue of rats with congestive heart failure (CHF) induced by over loaded pressure. Methods The model rats with CHF were established by suprarenal aortic constriction operation and divided into 5 groups ran

5、domly: sham operated, model control, Tinglishengmaiyin high, low dose groups and Xinbaowan group. The MS4000U biological signal collecting system was used to record and analyze the changes of LVSP, LVEDP and±dp/dtmax. Immunohistochemical method was used to observe the expressions of MMP9 and TI

6、MP1. Results In model control group, the LVEDP, dp/dtmax, the expression of MMP9 increased (P<0.05 or P<0.01) and the LVSP, +dp/dtmax, the expression of TIMP1 decreased (P<0.05 or P<0.01). Compared with model control group， LVEDP, dp/dtmax, the expression of MMP9 decreased (P<0.05 or

7、P<0.01), LVSP,+dp/dtmax, the expression of TIMP1 increased (P<0.05 or P<0.01) in the treatment groups. High dose group was significantly superior to low dose group and Xinbaowan group (P<0.05). Conclusions Tinglishengmaiyin can adjust the expressions of MMP9 and TIMP1, which may be one o

8、f the mechanisms of reversing myocardial model and improving heart function to treat CHF.【Key words】 Tinglishengmaiyin; Heart failure; MMP9; TIMP1 心室重塑是充血性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要病理生理過程，是由于一系列復(fù)雜的分子和細(xì)胞機(jī)制導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)、功能變化。近年研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)的表達(dá)變化在心室重塑及心力衰竭的發(fā)展過程中具有顯著作用1 。但有關(guān)中藥對CHF時(shí)MMPs及TIMPs表達(dá)變化

9、影響的報(bào)道較少。葶藶生脈飲是根據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床實(shí)踐研制出的治療CHF的效方。為了進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，本文觀察了其對壓力超負(fù)荷致充血性心力衰竭大鼠模型心肌組織MMP9及TIMP1表達(dá)的影響。     1 材料與方法1.1 藥物 葶藶生脈飲(河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院制劑室制備)由葶藶子、紅參、黃芪、五味子、丹參等組成，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水分別配成1.5、3.0 g/ml濃度的混懸液;心寶丸(汕頭市麒麟藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20070631)，實(shí)驗(yàn)時(shí)研磨成極細(xì)末，用蒸餾水配成濃度為0.024 g/ml的水溶液，放置4貯存?zhèn)溆谩?.2 儀器與試劑 MS4000U生

10、物信號定量記錄分析系統(tǒng)(廣州市龍飛達(dá)科技有限公司);DGB20電熱干燥箱(上海光華儀器廠)，2010水浴箱(天津泰斯特儀器有限公司)，CU600恒溫水浴震蕩器(姜堰市醫(yī)療器械有限公司)，BD120冰箱(青島海爾股份有限公司)，NikonFXA尼康光鏡顯微照相機(jī)(日本尼康株式會社)，LEICA RM2125石蠟切片機(jī)(萊卡上海分公司)，Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(廈門麥克奧迪儀器儀表有限公司)。MMP9、TIMP1免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)。1.3 動(dòng)物模型的建立、分組與給藥 健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量160200 g(河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。隨機(jī)分為

11、5組：假手術(shù)組、模型組、葶藶生脈飲高劑量組、葶藶生脈飲低劑量組、心寶丸對照組，每組12只。動(dòng)物造模參照相關(guān)文獻(xiàn)2 ，用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，劍突下腹正中切口，分層打開腹腔;在腎動(dòng)脈水平以上鈍性游離腹主動(dòng)脈，將7號針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，用0號手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和針頭一同結(jié)扎，然后緩慢將針頭撤出，使大鼠腹主動(dòng)脈直徑縮窄為0.7 mm，最后分層縫合關(guān)腹。假手術(shù)組開腹后將手術(shù)絲線穿過腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎，其他操作與手術(shù)組完全相同。于造模4 w后開始給藥。葶藶生脈飲高劑量組、低劑量組分別按30、15 g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服，對照組按0.24 g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)灌服，正常組和模型組

12、灌服生理鹽水。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1 ml/100 g計(jì)算，持續(xù)4 w。實(shí)驗(yàn)過程中假手術(shù)組、模型組、高劑量組、低劑量組、心寶組各死亡0、3、2、3、2只，最后進(jìn)入檢測的動(dòng)物分別為12、9、10、9、10 只。1.4 檢測指標(biāo)1.4.1 血液動(dòng)力學(xué)測定 于末次灌胃后禁食12 h，用20 %烏拉坦(0.75 g/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺，分離右頸總動(dòng)脈，在動(dòng)脈壁剪一小口，插入直經(jīng)為1 mm帶肝素的心導(dǎo)管，經(jīng)壓力轉(zhuǎn)換器接ms4000 u型生物信號定量分析系統(tǒng)，緩慢推進(jìn)導(dǎo)管，觀察示波器，當(dāng)出現(xiàn)左室波型后停止推進(jìn)，穩(wěn)定2 min后記錄LVSP、LVEDP、±dp/

13、dtmax等。1.4.2 免疫組化法檢測MMP9、TIMP1表達(dá) 于末次灌胃后禁食12 h，麻醉狀態(tài)下迅速剖取心臟，切取約0.5 cm3大小的左室組織，用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片脫蠟水化后分別做MMP9及 TIMP1的免疫組織化學(xué)染色。采用常規(guī)親和素生物素過氧化物酶技術(shù)，以磷酸緩沖液代替一抗作為陰性對照，MMP9、TIMP1陽性表現(xiàn)為胞漿染成淺黃色、棕黃色。每個(gè)標(biāo)本選取3張切片，每張切片取5個(gè)視野，采用Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，檢測MMP9和TIMP1蛋白表達(dá)情況(積分吸光度)，取平均值。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以

14、x±s表示，組間比較用單因素方差分析。2 結(jié) 果2.1 葶藶生脈飲對實(shí)驗(yàn)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組LVSP、+dp/dtmax顯著降低(P<0.01)，LVEDP、dp/dtmax顯著升高(P<0.01);與模型組比較，各治療組LVSP、+dp/dtmax顯著升高(P<0.01)，LVEDP、dp/dtmax顯著降低(P<0.01)。其中，高劑量組+dp/dtmax高于心寶組和低劑量組(P<0.01)，dp/dtmax低于心寶組和低劑量組(P<0.01);低劑量組+dp/dtmax低于心寶組，dp/dtmax高于心寶組(P

15、<0.01);而LVSP、LVEDP的變化在各治療組之間無明顯差異(P>0.05)。表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較(x±s)與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;與心寶組比較：3)P<0.01;與低劑量比較：4)P<0.01     2.2 葶藶生脈飲對實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織MMP9、TIMP1表達(dá)的影響 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組MMP9的表達(dá)及MMP9/TIMP1比值明顯升高(P<0.01)，TIMP1的表達(dá)明顯降低(P<0.01);與模型組比較，各治療組MMP9表達(dá)及MMP9/T

16、IMP1比值明顯降低(P<0.01)，TIMP1表達(dá)明顯升高(P<0.01)。其中，高劑量組MMP9的表達(dá)及MMP9/TIMP1比值低于低劑量組和心寶組(P<0.01)，TIMP1的表達(dá)高于低劑量組和心寶組;低劑量組與心寶組比較各項(xiàng)指標(biāo)變化無明顯差異(P>0.05)。表2 各組大鼠心肌組織MMP9、TIMP1蛋白表達(dá)及MMP9/TIMP1的比較3 討 論MMPs是一組能特異地降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)成分的鋅(Zn2+)依賴酶家族，可降解除多糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分;還可通過基質(zhì)降解時(shí)釋放強(qiáng)有力的基質(zhì)合成分子如基質(zhì)素及一些生物活性

17、因子，包括轉(zhuǎn)化生長因子(TGF1)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等調(diào)節(jié)膠原的合成，最終破壞心臟纖維膠原網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致心肌纖維化心室重構(gòu)心臟泵功能衰竭。MMPs在心室重構(gòu)和心力衰竭中起著重要作用3 。MMPs主要分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素及膜型MMPs (MTMMP)。明膠酶包括明膠酶A(MMP2)和B(MMP9)，兩種明膠酶是目前研究較多且具有降解間質(zhì)蛋白的作用4 ，其中，MMP9在心衰的發(fā)生發(fā)展中起著更為重要的作用 5 。 內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是MMPs的特異性抑制劑。包括有TIMP1、TIMP2、TIMP3、TIMP4。正常情況下，TIMPs與MMPs呈11的比例形

18、成MMP-TIMP復(fù)合物阻斷MMPs與底物結(jié)合，調(diào)節(jié)MMPs的活性。其中TIMP1可有效抑制除MMP2和MT1MMP以外大多數(shù)MMPs的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，敲除TIMP1的小鼠，左室?guī)缀涡螤畎l(fā)生改變。心肌組織中TIMP含量降低，且MMPs增加，心腔變形、擴(kuò)大，造成心室重構(gòu)6 。正常情況下，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的MMPs和抑制MMPs的內(nèi)源性TIMPs的良好平衡在維持正常的心臟結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。心衰發(fā)生后，降解細(xì)胞外基質(zhì)的MMPs升高，而MMPs內(nèi)源性抑制劑TIMPs下降，兩者比例失調(diào)。慢性心衰屬于祖國醫(yī)學(xué)的心悸、怔忡、咳喘、水腫等病證的范疇。氣虛、血瘀、水停是心衰的基本病機(jī)，屬于本虛標(biāo)實(shí)之證，即心臟氣虛為本，血瘀水停為標(biāo)。益氣活血，強(qiáng)心利水為其有效治法。因此，精心篩選相關(guān)藥物組成葶藶生脈飲，經(jīng)臨床應(yīng)用療效滿意。方中黃芪益氣利水;葶藶子強(qiáng)心利水;丹參、紅花活血祛瘀;益母草活血利水;