高中生物 專(zhuān)題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 5.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

1、5.2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 學(xué)習(xí)目標(biāo)學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)PCR的原理和PCR的基本操作學(xué)習(xí)過(guò)程一、基礎(chǔ)知識(shí)1PCR原理填寫(xiě)下列表格參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈合成子鏈的原料DNA聚合酶引物DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱(chēng)為 ，而磷酸基團(tuán)的末端稱(chēng)為 。DNA聚合酶不能 開(kāi)始合成DNA，而只能 ，因此，DNA復(fù)制需要引物。DNA的合成方向總是 。在DNA的復(fù)制過(guò)程中，復(fù)制的前提是 。在體外可通過(guò)控制 來(lái)實(shí)現(xiàn)。在 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為 。PCR利用了DNA的 原理，通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過(guò)程的

2、溫度高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活，后來(lái) 的DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了PCR的效率。PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供： ， ， ， ，同時(shí)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。2PCR的反應(yīng)過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷 循環(huán)，每次循環(huán)可以分為 、 和 三步。從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由 延伸而成的DNA單鏈會(huì)與 結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能 ，使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。3實(shí)驗(yàn)操作在實(shí)驗(yàn)室中，做PCR通常使用 ，它是一種薄壁塑料管。具體操作時(shí)，用微量移液器，按PCR反應(yīng)體系的配方在 中依次加入各組分，再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程

3、序即可。4操作提示為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的 、 、 以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行 。PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在 儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，移液管上的槍頭要 。疑難點(diǎn)撥PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題，被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等各方面。2細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分及其作用解旋酶：打開(kāi)DNA雙鏈

4、DNA母鏈：提供DNA復(fù)制的模板 4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈 引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3，端開(kāi)始連接脫氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為2030個(gè)核苷酸）3DNA的合成方向DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模ǔNA的羥基末端稱(chēng)為3，端，而磷酸基團(tuán)的末端稱(chēng)為5，端。DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從3，端延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3，端開(kāi)始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5，端向3，端

5、延伸。4PCR的反應(yīng)過(guò)程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性（當(dāng)溫度上升到90oC以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈）、復(fù)性（溫度下降到50oC左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合）和延伸（溫度上升到72oC左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈）三步。從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。5PCR技術(shù)與DNA的復(fù)制PCR反應(yīng)是通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在

6、體外反復(fù)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制，所以有關(guān)PCR反應(yīng)的題目與DNA復(fù)制的原理相同，計(jì)算方法也大體相同。例如：PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累，其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段。（230）例.一個(gè)由15N標(biāo)記的DNA分子，放在沒(méi)有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng)，利用PCR循環(huán)5次后標(biāo)記的DNA分子總數(shù)的（ ）A. 1/10 B. 1/5 C【答案】C【解析】一個(gè)DNA分子利用PCR技術(shù)循環(huán)5次后產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為2n。而DNA的復(fù)制是半保留復(fù)制，其特點(diǎn)是：新形成的DNA雙鏈，一條是來(lái)自親代DNA分子的母鏈，另一條是新形成的子鏈。這樣最初由15N標(biāo)記的DNA分子復(fù)制后，其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代DNA分子中，