重樓皂苷對SGC-7901細胞增殖抑制及誘導凋亡的實驗研究

1、重樓皂苷對SGC-7901細胞增殖抑制及誘導凋亡的實驗研究        【摘要】     目的研究重樓皂苷對SGC-7901人低分化胃腺癌細胞的作用及影響機制。方法在體外應用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法觀察重樓皂苷對細胞生長的抑制作用；應用Fluo-3AM 熒光標記技術(shù)和激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測不同藥物濃度處理的SGC-7901人低分化胃腺癌細胞Ca2+i 的變化。結(jié)果重樓皂苷可顯著抑制腫瘤細胞的增殖作用；重樓皂苷作用24h后能引發(fā)SGC-7901細胞C

2、a2+i的明顯增加。結(jié)論重樓皂苷可能通過增加細胞內(nèi)Ca2+i誘導細胞凋亡，從而發(fā)揮其抗SGC-7901細胞增殖的作用。     【關(guān)鍵詞】  重樓 皂苷 激光掃描共聚焦顯微鏡 凋亡    重樓又名“七葉一枝花”，為植物根莖，是云南白藥的主要組成成分，具有止血、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等廣泛藥理作用，其具生物活性的主要成分是多種甾體皂苷。目前，中藥重樓及其復方抗腫瘤作用機制多集中在細胞毒和調(diào)節(jié)機體免疫功能等方面1，2。本研究的目的在于探討重樓皂苷是否通過誘導細胞凋亡這一途徑而發(fā)揮其抑制腫瘤細胞增殖的作

3、用。1  材料與儀器1.1  藥品與試劑重樓皂苷（天津市中藥飲片廠）；Fluo-3/AM （sigma公司）。1.2 儀器ALISEI隨機型全自動酶標板分析儀（意大利RAPIM集團）；低溫超速立式離心機 （Tomy Seiko Co.Ltd,MRX-150型）；激光掃描共聚焦顯微鏡（美國伯樂公司，Bio-rad Radiance 2000）。2 方法2.1  MTT法測定重樓皂苷對腫瘤細胞生長的抑制實驗3將濃度為5×104 /ml的SGC-7901細胞懸液接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后，加入重樓皂苷藥液使其終濃度分別為5，10，20，40，80g/ml，

4、同時設(shè)陰性對照組、順鉑陽性對照組，每組5個平行孔， 37、5CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24，48，72 h后，離心棄上清液，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心棄上清液后加入鹽酸異丙醇振蕩10 min，應用酶標儀于490 nm處測吸光度值（A）。按公式計算細胞生長抑制率。實驗重復3次。生長抑制率（%）=(對照組OD值用藥組OD值)/對照組OD值×100%。2.2 激光共聚焦觀察重樓皂苷對SGC-7901細胞內(nèi)Ca2i的影響42.2.1 SGC7901細胞株的處理分別設(shè)不同濃度重樓皂苷藥物組與陰性對照組，SGC-7901細胞以3×106/ml接種于六孔板中的載玻片上，培養(yǎng)24 h后，加

5、入重樓皂苷藥液使其終濃度分別為5，10，20，40 g/ml，和不加藥液的細胞培養(yǎng)基作為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用PBS液漂洗細胞。將載玻片放入Petri皿中，加入10 mol/L Flu3AM應用液，37下孵育細胞約40 min，用PBS液洗脫細胞外未結(jié)合的熒光，再于37下保溫約10 min， LSCM下觀察。2.2.2 LSCM動態(tài)觀察重樓皂苷對SGC-7901細胞內(nèi)Ca2i的變化5LSCM觀察負載Fluo-3AM的SGC-7901細胞未給藥時細胞內(nèi)熒光強度，即Ca2i水平，時間300S；棄上清液，加入重樓皂苷終濃度為10 g/ml的藥液，孵箱內(nèi)孵育10 min后，上機觀察SGC790

6、1細胞內(nèi)Ca2i變化，觀察時間300S；同法操作，觀察藥物濃度為20，40 g/ml時對細胞內(nèi)Ca2i的影響。2.2.3  LSCM靜態(tài)觀察重樓皂苷處理24h后SGC-7901細胞內(nèi)Ca2i的變化LSCM觀察負載Fluo-3AM的SGC-7901細胞給藥及未給藥時細胞內(nèi)的熒光強度，即Ca2i水平，激發(fā)波長為488 nm，檢測波長為530 nm，每組隨機取5個視野，計算細胞總數(shù)及總熒光強度（FI）值，取其平均值代表平均細胞內(nèi)Ca2i。2.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，實驗結(jié)果采用t檢驗。3 結(jié)果3.1 重樓皂苷對SGC-7901細胞生

7、長增殖的抑制作用重樓皂苷對SGC-7901腫瘤細胞具有明顯的生長抑制作用，且呈劑量、時間依賴關(guān)系。結(jié)果見表1。表1  重樓皂苷對體外培養(yǎng)的SGC-7901細胞的抑制作用（略）3.2 LSCM觀察腫瘤細胞內(nèi)鈣離子強度的變化LSCM動態(tài)觀察Ca2i濃度的變化，對照組及重樓皂苷處理組細胞內(nèi)Ca2i濃度隨掃描時間的延長均有緩慢上升趨勢；但在同一掃描時段，藥物處理后細胞內(nèi)Ca2i濃度與對照組比較沒有統(tǒng)計學意義，即不同濃度的重樓皂苷對細胞內(nèi)鈣離子的動態(tài)變化沒有影響。結(jié)果見表2。表2  重樓皂苷對SGC7901細胞Ca2i作用的動態(tài)變化（略）表3  重樓皂苷處理24h后SGC-

8、7901細胞內(nèi)Ca2i的靜態(tài)變化（略）4 討論重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖。本品味苦，微寒，有小毒，歸肝經(jīng)；具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚等功效，用于治療疔瘡癰腫，咽喉腫痛，毒蛇咬傷，跌打傷痛，驚風抽搐?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)本品提取物具有止血、抗炎、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和抗癌等作用6。重樓主要化學成分為甾體皂苷，約占總化合物數(shù)目的80，其皂苷元多為薯蕷皂苷元(Dipsgenin)，次為偏諾皂苷元(Pennogenin)，并含有氨基酸、甾酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物，其中重樓皂苷為其抗腫瘤有效成分。本研究中重樓皂苷對人低分化胃腺癌SGC7901細胞增殖具有抑制作用且其作用呈時間、劑量

9、依賴性關(guān)系。目前有關(guān)中藥重樓抗腫瘤作用機制的研究尚少，其研究多集中在細胞毒作用和調(diào)節(jié)機體免疫功能方面，對其誘導細胞凋亡的作用機理還缺乏系統(tǒng)了解，故本實驗從分子水平對其誘導腫瘤細胞凋亡的機理作進一步的探討。鈣離子是機體的重要元素，細胞的許多生理代謝活動都有鈣離子的參與，它在細胞的生命活動中擔當著重要的角色。早期研究者認為凋亡過程中胞漿內(nèi)的 Ca2+ 濃度升高是凋亡的結(jié)果之一。郭靜等7在多種細胞模型中對各種凋亡刺激劑的檢測結(jié)果表明 Ca2+濃度的升高在凋亡早期就已經(jīng)發(fā)生，Ca2+可能是主動調(diào)控凋亡起始的因素之一。本實驗應用激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）與熒光標記技術(shù)觀察重樓皂苷處理后的SGC-7

10、901細胞內(nèi)鈣離子濃度的動態(tài)變化以及處理24 h后細胞內(nèi)鈣離子的熒光強度的變化，發(fā)現(xiàn)加入重樓皂苷后LSCM連續(xù)掃描300 s, Ca2i的熒光強度與未加藥前比較沒有顯著變化，此時藥物對細胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯影響，考慮與重樓皂苷分子量較大，短時間內(nèi)很難通過細胞膜進入細胞而發(fā)揮其作用有關(guān)；而藥物處理細胞24 h后，SGC-7901細胞內(nèi)鈣離子熒光強度較陰性對照組明顯增強，且有隨著藥物濃度的增加呈增強的趨勢，提示重樓皂苷可能通過升高細胞內(nèi)鈣離子水平誘導細胞凋亡，從而起抑制腫瘤細胞增殖的作用。綜上所述，本實驗在肯定重樓皂苷能抑制SGC-7901細胞增殖的同時，采用LSCM測定細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化提示

11、重樓皂苷作用后可能通過誘導SGC-7901細胞凋亡來發(fā)揮其抑制細胞增殖的作用，這為進一步研究重樓皂苷對其他腫瘤細胞的增殖抑制作用提供了一定的理論基礎(chǔ)。但由于目前僅在體外對重樓皂苷誘導SGC-7901細胞凋亡進行了研究，至于其在體內(nèi)對細胞凋亡的影響尚未清楚；另外有關(guān)其抗腫瘤的詳細生化機制還有待進一步闡明。    【參考文獻】  1金煒東,陳孝平，蔡紅嬌，等.重樓提取物對HepG2細胞的毒性作用J.華中科技大學學報（醫(yī)學版）,2006，35(1):103.2許玲,劉嘉湘.益肺抗瘤飲對肺癌轉(zhuǎn)移及免疫功能的影響J.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,1997,17(7):401.3邊洪榮，李小娜，王會敏.重樓的研究及應用進展J.中藥材，2002，25（3）：218.4姜泊.細胞凋亡基礎(chǔ)