2015版中國(guó)藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法驗(yàn)證實(shí)施方案

1、2015版中國(guó)藥細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 法驗(yàn)證實(shí)施方案作者:日期:個(gè)人收集整理，勿做商業(yè)用途記錄編碼：LZ-B00-TJL-2011-010-A序號(hào):北京靈澤醫(yī)藥技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司一次性腸外營(yíng)養(yǎng)輸液袋內(nèi)細(xì)菌毒素檢查法驗(yàn)證方案編制：李樹(shù)權(quán)審核：批準(zhǔn)：日期：2012.11.7日期：日期：個(gè)人收集整理，勿做商業(yè)用途1. 驗(yàn)證目的為公司產(chǎn)品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法提供依據(jù)。2. 驗(yàn)證依據(jù)3. 中華人民共和國(guó)藥典2010年版第二部附錄幻E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法4. 驗(yàn)證條件無(wú)菌操作間（萬(wàn)級(jí)）5. 驗(yàn)證準(zhǔn)備4.1試驗(yàn)設(shè)備設(shè)備名稱(chēng)設(shè)備編號(hào)設(shè)備狀態(tài)內(nèi)毒素檢測(cè)儀A10-2012-A-004-0完好鼓風(fēng)式干燥箱A10-2010-A-0

2、07-1完好5.2試劑試劑名稱(chēng)來(lái)源批號(hào)內(nèi)毒素工作品（10EU/ml）湛江博康海洋生物1107010鱟試劑(0.25EU/ml)湛江博康海洋生物1206110內(nèi)毒素檢查用水湛江博康海洋生物1204065.3樣品:樣品名稱(chēng)規(guī)格型號(hào)批號(hào)數(shù)量一次性腸外營(yíng)養(yǎng)輸液袋PN-E-W 3500ml24.4實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1）實(shí)驗(yàn)用具移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無(wú)熱原吸頭）、凝集管（10mrm 75mm、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、封口膜、時(shí)鐘、753酒精棉、剪刀、砂輪、耐熱器皿須經(jīng)180C烘烤120min。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等， 應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾的器械。2）使用

3、塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，置 30%雙氧水中浸泡4 小時(shí)，再用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水充分沖洗后 60C烘干備用?；蛴靡淮涡詿o(wú)熱源吸頭。5.樣品制備（供試液溶液）將20ml內(nèi)毒素檢查用水注入到一次性腸外營(yíng)養(yǎng)輸液袋內(nèi)，37C孵育60min。作為供試品溶液。6. 鱟試劑靈敏度復(fù)核鱟試劑靈敏度復(fù)核的目的不僅是考察鱟試劑的靈敏度是否準(zhǔn)確，也是考查檢驗(yàn) 人員操作方法是否正確及實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。因此要求實(shí)驗(yàn)室在使用一批新的 鱟試劑進(jìn)行供試品干擾實(shí)驗(yàn)或供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查前必須進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核 實(shí)驗(yàn)。6.1實(shí)驗(yàn)操作6.1.1細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：1）取細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或工作標(biāo)準(zhǔn)

4、品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)，啟開(kāi)過(guò)程中應(yīng)防止玻璃屑 落入瓶?jī)?nèi)；2）按照標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15min。然后進(jìn)行稀釋?zhuān)苽涑?個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi) 毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,即2.0入、1.0入、0.5入、0.25入（入為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏 度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合 30秒鐘（詳細(xì)過(guò)程請(qǐng)參見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品使用說(shuō)明書(shū)）。6.1.2待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備：取規(guī)格為0.1mL/支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開(kāi)備用。每支加

5、入0.1mL檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶 壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。若待復(fù)核鱟試劑的規(guī)格不是0.1mL/支時(shí)，取若干支按其標(biāo)示量加入檢查用水復(fù)溶，充分溶解后將鱟試劑溶液混和在一起，然 后每0.1mL分裝到10mm 75m凝集管中，要求至少分裝18管備用。6.1.3加樣將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4 支（管），每支分別加入0.1mL 2.0入、1.0入、0.5入、0.25入的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液； 1 列 2支（管），每支分別加入0.1mL檢查用水。6.1.4加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同 試管架放入（37 1） C水

6、浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫（60 2）min。6.1.5觀察并記錄結(jié)果。將試管架從水浴或適宜恒溫器中輕輕取出，避免振動(dòng)，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180觀察，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者 為陽(yáng)性，記錄為（+）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為 JL 陰性，記錄為（-）。保溫和拿取試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。6.1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算如最大濃度2.0入4管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25入4管均為陰性，陰性對(duì)照為陰性 時(shí)實(shí)驗(yàn)為有效，按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié) 果（入c）:入 c=antilg（刀X/4 ）;式中X為反應(yīng)終

7、點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg ）,反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶 液中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。6.1.7結(jié)果判斷當(dāng)心在0.5入2.0 2（包括0.5入和2.0片時(shí)判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾實(shí)驗(yàn)和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查， 并以（標(biāo)示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。內(nèi)毒素濃度、EU/mQ編號(hào)0.50.250.1250.0625NC反應(yīng)終點(diǎn)濃度12347.內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)7.1試驗(yàn)溶液配置:編號(hào)內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液2B2入/供試品溶液供試品溶液122 入(0.5EU/ml )1 入(0.25EU/ml )44480.5 入(0

8、.125EU/ml )0.25 入(0.0625EU/ml )4412 入(0.5EU/ml )421 入(0.25EU/ml )4C2入/檢查用水檢查用水40.5 入(0.125EU/ml )480.25 入(0.0625EU/ml )4D無(wú)/檢查用水2注：A為供試品溶液；B為干擾試驗(yàn)系列；C為鱟試劑標(biāo)示的靈敏度的對(duì)照系列;D為陰性對(duì)照試驗(yàn)將已充分溶解的鱟試劑28支（管）放在試管架上，排成10列，其中A列2支管，每支加入0.1ml的供試品溶液，B為4列B1-B4每列4支（管），每支分別加入0.1mL 2.0入、1.0入、0.5入、0.25入的用供試品溶液稀釋的內(nèi)毒素溶液；C為4列C1-C4每

9、列2支（管），每支分別加入0.1mL 2.0入、1.0入、0.5入、0.25入的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液， 列2支（管），每支分別加入0.1mL檢查用水。7.2加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架 放入（37 1）C水浴或適宜恒溫器中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫（60 2）min 。7.3觀察并記錄結(jié)果。將試管架從水浴中輕輕取出，避免振動(dòng)，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180。觀察，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為（ + ）;未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（-）編號(hào)內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行

10、管數(shù)結(jié)果A無(wú)/供試品溶液212入421入4B2入/供試品溶液40.5入480.25 入412入4C2入/檢查用水21入440.5入480.25 入4D無(wú)/檢查用水27.4結(jié)果判斷：只有溶液 A和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液 C 的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，實(shí)驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算系列溶液C和B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Ea和XI）。Es=an tilg（刀 Xs/4 ）Et= an tilg（刀 Xt/4 ）式中Xs和Xt分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg ）.當(dāng)Es在0.5入2.0入（包括0.5入和2.0 及在Et在0.5Es2.0 Es（包

11、括0.5Es和2.0 Es）時(shí)，認(rèn)為供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。若供試品溶液在小于MVD勺稀釋倍數(shù)下對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD勺進(jìn)一步稀釋?zhuān)僦貜?fù)干擾試驗(yàn)。7.5實(shí)驗(yàn)結(jié)論：8.樣品檢驗(yàn)8.1陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用檢查用水將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2.0入濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。8.2供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備用待檢測(cè)的供試品溶液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2.0入濃度的內(nèi)毒素溶液。8.3陰性對(duì)照液即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。8.4鱟試劑的準(zhǔn)備方法同6.1.2。8.5加樣取8支（管）溶解好的鱟試劑，其中2支加入0.1mL供試品溶液作為供試品管。2 支加入0.1mL陽(yáng)性對(duì)照溶液作為陽(yáng)性對(duì)照管，2支加入0.1mL

12、檢查用水作為陰性對(duì)照， 2支加入0.1mL供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照管。8.6將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入（37）C水浴或適宜恒溫器中，保溫（60 2）min。保溫和取放試管過(guò)程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。8.7結(jié)果判斷1）當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性，供試品陽(yáng)性對(duì)照都為陽(yáng)性，且陰性對(duì)照都為陰性時(shí)，實(shí) 驗(yàn)方法有效；2）若供試品2管均為陰性，認(rèn)為該供試品符合規(guī)定；3）如供試品2管均為陽(yáng)性，應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定；4）如2管中1管為陽(yáng)性，1管為陰性，按上述方法另取4支供試品管復(fù)試，4管中如有1 管為陽(yáng)性，即認(rèn)為不符合規(guī)定。8.8實(shí)驗(yàn)結(jié)論:樣品及對(duì)照加量試劑樣品管樣品陽(yáng)性陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照1號(hào)2號(hào)3號(hào)4號(hào)5號(hào)6號(hào)7號(hào)8號(hào)鱟試劑0.1mL0.1mL0.1mL0.1mL0.1mL0.1ml0.1mL0.1mL供試液0.1mL0.1mL/內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì) 照溶液/0.1mL0.1mL供試液陽(yáng)性對(duì) 照溶液/0.1mL0.1mL/細(xì)菌內(nèi)毒素 檢查用水/0.1mL0.1mL/供試品結(jié)果1供試品結(jié)果29總體評(píng)價(jià)及建議驗(yàn)