westernblot常見問題及處理總結(jié)

1、免疫細胞研究 western blotWestern Blot 常見問題及處理總結(jié)阿木1、western blot 的優(yōu)點答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達 pg 級。方便，特異性高。2、為什么我的細胞提取液中沒有目標蛋白答： 原因有很多 : a) 你的細胞中不表達 這種蛋白質(zhì)，換一種細胞； b) 你的細胞 中的蛋白質(zhì)被降解掉了，你必需加入PMSF抑制蛋白酶活性；c)你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。3、我的細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢答： a) 有沉淀可能因為你的蛋白沒有變 性完全， 可以適當提高 SDS 濃度，同時將 樣品煮沸時間延長， b) 也

2、不排除你的抗 原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液 即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10KD，請 問怎么做 WB答：可以選擇 卩ml的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起， 再轉(zhuǎn)移其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱，怎么加強答：可以加大抗原上樣量。 這是最主要的同時也可以將一抗稀釋比例降低。6、膠片背景很臟，有什么解決方法答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛?，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。7、目標帶是空白，周圍有背景，是為什么答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨 界點，反應(yīng)時間不長， 將周圍底物催化完， 形成了空白即“反亮現(xiàn)象”。將一抗和二 抗?jié)舛?/p>

3、降低，或更換新底物。、我的膠片是一片空白，是怎么回事答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。a) 二抗的HRP活性太強，將底物消耗光；b) ECM底物中H2O2不穩(wěn)定，失活；c) ECL 底物沒覆蓋到相應(yīng)位置； d) 二抗失活。9、我在顯影液中顯影 1 分鐘和 5 分鐘后 ,底片漆黑一片 , 是什么原因呢答： a) 可能是紅燈造成的 , 膠片本來就 被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作 看是否有改善 . ； b) 顯影時間過長。10、DAB好還是ECM子答：DAB有毒，但是比較靈敏，是 HRP最 敏感的底物；ECM吉果容易控制，但被催 化時靈敏度差一點，但如果達到閥值

4、，就 特別靈敏，可以檢測 pg 級抗原。要看你 實驗的情況。11 、抗原檢測出的分子量比資料上的大， 是怎么回事答： a) 抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇 量，煮沸變性時間延長， 可以打開二聚體b） 蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時 Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么答：可能是：a）樣品濃度過低；b）轉(zhuǎn)移時間不夠，。13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一 定要加NaF等答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和 western blot 試驗嗎做這兩個試驗時

5、的一抗和二抗可以共用嗎答： 免疫組化可以用來進行定位，但 是不能精確定量，而且有時會有假陽性， 不易與背景區(qū)分； Western blot 可以特異 性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定量，但是 不能定位。 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。15、做 Western Blot 時，提取蛋白后凍 存（未加蛋白酶抑制劑） ，用的博士德的 一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差， 上樣量已加到120卩g,換了個santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因蛋白酶抑制劑 單加PMSF亍嗎 答：懷疑是樣品問題，可能是： 1，樣品 不

6、能反復(fù)凍融； 2，樣品未加蛋白酶抑制 劑。同時，建議檢查 Western Blot 過程， 提高一抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。16、細胞水平要做 western blot ，多少細胞提的蛋白夠做 western blot答：一般5X 10人6就足夠了17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么這樣對 western blot 有無影響答：能，沒有問題。同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot 檢測嗎答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所

7、用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上 NaF去抑 制磷酸化酶的活性。20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不 到 1 微克，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有 一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染 膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是 顏色變淡了，有什么辦法可以解決 答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有 轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間，加 20甲醇。21、想分離的蛋白是分子量 200kd 的，SDS-PAG電泳的分離膠濃度多大合適積 層膠的濃度又該用多少這么大分子量的 蛋白容易作 Western Blot 嗎答：200kd的蛋白不好做，分離膠用7%,積層膠 22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量答

8、：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標 分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般 地，超載 30是不會有問題的。 如果已經(jīng) 超了不少了，而且小分子量的也要，可以 考慮加大膠的厚度，可以試試的。23、蛋白變性后可以存放多久答：OC, 兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉（也是被酶水解了 ） 。24、我所測定的蛋白分子量是105KD按 理說分離膠應(yīng)當采用 %，但資料卻要求分 離膠和濃縮膠均采用 1 1的配方，不知為 何答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣

9、的方案后， 封閉液是否要作調(diào)整，能否再用 5的脫 脂奶粉呢好像有資料說脫脂奶粉會影響 親和素生物素的生成，是嗎 解答：不能使用脫脂奶粉，因為脫脂奶粉中含生物素，用BSA代替應(yīng)該好一點.26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關(guān)系嗎答：Western Blot 般上樣 30 - 100 微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、 一二抗的量和孵育時間都有關(guān)系，也與顯 色時間長短有關(guān)。開始摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都可以量多一點時 間長一點，當然背景也就出來了。要拿到 好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗 體不好的話就需要反復(fù)地試了，當然有的 不適合 Western Bl

10、ot 的怎樣做也不行。27、做組織樣品的 western 的時候，怎樣處理樣品答：必須進行研磨、勻漿、超聲處理，蛋 白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋白 需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白 可能還要分步抽提 （超速離心 ） 。還有一點 就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意 抑制蛋白酶的活性（加入PMSF）。28、問大分子量蛋白200KD 在做 western要注意什么呢答：做 200kd 蛋白的 Western Blot 時要注意，分離膠最好選擇 >7%的；剝膠時要小心；轉(zhuǎn)移時間需要相應(yīng)延長；要做分子 量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）29、有什么方法可以提高上樣量答：a）可以濃縮樣

11、品；增大上樣體積來增 大上樣量；b）用5倍的上樣緩沖液來稀釋 30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求答：上樣量要根據(jù)實驗的要求來定， 如果要求是定量和半定量的 Western Blot則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超載 .31、一抗，二抗的比例是否重要答：比較重要，調(diào)整好一抗， 二抗的比例， 可以去掉部分非特異的本底。32、要做磷酸化某因子 Western Blot ，其 二抗有何要求答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選 擇，一般推薦用HRF標記的二抗。33、免疫組化和 Western Blot 可以用同一種抗體嗎答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變

12、性處 理的抗原決定簇（又稱表位） ，有些表位 是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位 不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的 蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間 結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果你所用 的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基 酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同 時用于免疫組化和Western，而如果抗體 識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。34、 Western Blot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使 用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用 2 3次。稀釋后應(yīng)在 23天內(nèi)使用， 4度 保存，避免反復(fù)凍融。35、在做 Western Blot 時，PVDF膜用

13、甲醇浸泡的目的答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF莫上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的 抗原可以在同一張膜上嗎答：可以。37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好， 為什么答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢，你延長轉(zhuǎn)移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。38、做 Western Blot時，同樣的抗體免疫組化能做出，而 Western Blot 卻不能 答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說 明，是否能做 Western Blot 和免

14、疫組化39、如果是6X8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗答：一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的 一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育 體積一般最少為 35ml。40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果答：無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩 次的緩沖液41、跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什 么原因呢是有的成分不對嗎答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸 發(fā)了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加 點水保持濕度就可以了； 也可能母液 （30% 聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份 觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選 用好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD

15、中至66KD大至170KD可以一次做好嗎答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd 和 66kd 可以一起轉(zhuǎn)，12% SDS-PAGJE濕轉(zhuǎn) 120mA， 45-60min 就可以了， 可以根據(jù)你實驗室的經(jīng)驗調(diào)節(jié)； 170kd 用7%SDS PAGE， 200mA 90-120min。43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜 上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20%甲 醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白 質(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和 NC膜的 結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇 對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移 緩沖液加入終濃度 %SD，S 也是為了增加轉(zhuǎn) 移效

16、率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑 的NC膜（微米）.44、我用的是可視 marker ，但是電泳總跑不全條帶，請問什么原因怎樣改善膠用%，12%，都是這樣marker是新買的答：一般來說，是小分子量 Marker 跑走 了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯的選擇。45、是否 Western Blot 實驗半定量一定要加ACTIN內(nèi)參答：對于發(fā)表文章的實驗最好加內(nèi)參，實驗嚴謹。46、核內(nèi)抗原 Western Blot 內(nèi)參選擇什么合適答：可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中 的表達是很穩(wěn)定的，有很多都可以當成內(nèi) 參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。47、做半定量 Western B

17、lot ，內(nèi)參B -actin , GAPD哪個好答：選用 beta-actin 就可以48、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎受不受組織來源的影響胞膜和胞漿有區(qū)別嗎答：一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑 制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有 文獻特別指明用特殊的方法，一般來說都 沒有區(qū)別。49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是 5%的 TBST 脫脂奶粉”，其中TBST最后那個T是 Twee n嗎，濃度多大答：是 Tween 配方如下：Tris-Buffered base： 加水 800ml 溶解 , 加 500-1000ulSaline Tween-20 (TBST), NaCl：g， Tris的 Tween-20, 用 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 , 加水 定容至 1L.50、封閉，一抗，二抗時的溫度有沒有什 么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在 4 度下 答：均可在室溫進行，如果時間不夠，一 抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后 4 度過夜。51、請問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水 作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗 幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。PVDF 膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合， 同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的 話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落， 結(jié)果