血紅素氧合酶

1、血紅素氧合酶【關(guān)鍵詞】 血紅素氧合酶摘要：目的 探討血紅素氧合酶1(HO1)對肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 將大鼠隨機(jī)分為：正常組(N組)、硬化組(LC組)、假手術(shù)組(S組)、手術(shù)組(I/R組)和給藥組(I/R+hemin組)。除正常組外其余各組大鼠皮下注射體積分?jǐn)?shù)為40%的CCl4溶液，每周2次，11周后形成肝硬化模型；停藥1周后進(jìn)行肝臟缺血再灌注；于再灌注后6h檢測肝功能、抗氧化能力，免疫組織化學(xué)檢測核轉(zhuǎn)錄因子(NFB)、天冬半胱酶(caspase3)和HO1蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 給予hemin誘導(dǎo)HO1高表達(dá)能減輕肝臟缺血再灌注后肝細(xì)胞損傷，提高錳超氧化物歧化酶(MnSOD

2、)水平，降低caspase3、NFB陽性表達(dá)。結(jié)論 HO1能有效地減輕肝硬化肝臟缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與提高M(jìn)nSOD水平、降低caspase3及NFB表達(dá)有關(guān)。關(guān)鍵詞：血紅素氧合酶1；肝臟缺血再灌注；NFB；caspase3Protection of heme oxygenase1 against hepaticischemia reperfusion injury in cirrhotic ratsABSTRACT: Objective To study the proctective effect of heme oxygeanse1(HO1) on cirrhotic rats a

3、fter hepatic ischemia reperfusion injury. Methods All the rats were randomly divided into 5 groups as follows: normal group(N), liver cirrhosis group (LC), sham operation group (S), ischemia reperfusion group (I/R), and I/R+hemin group. Except for N group, the other groups were injected with 40% CCl

4、4 twice a week. After 11 weeks, the model of liver cirrhosis was formed. The segmental (70%) hepatic ischemia reperfusion operation was carried out one week later. The animals were sacrificed 6h after reperfusion. Blood was collected to measure the liver function, antioxidative ability, NFB and casp

5、ase3, and HO1 expressions were studied by immunohistochemistry method. Results Administration of hemin to induce high HO1 expression could lessen hepatic injury, increase MnSOD enzyme level, and decrease caspase3 and NFB expresssion. Conclusion HO1 plays an important role in protecting liver cirrhos

6、is against ischemia reperfusion injury by increasing MnSOD enzyme level and decreasing expression of caspase3 and NFB.KEY WORDS:heme oxygenase1; hepatic ischemia reperfusion; NFB; caspase3上消化道大出血、肝臟外科手術(shù)等過程中都經(jīng)歷肝臟缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)損傷這一臨床常見的病理變化過程。肝硬化時肝臟對缺血再灌注損傷更加敏感。近年人們發(fā)現(xiàn)血紅素氧合酶1(heme oxy

7、genase1, HO1)對肝臟缺血再灌注損傷有保護(hù)作用1。本實(shí)驗采用大鼠肝硬化肝臟缺血再灌注模型，觀察誘導(dǎo)HO1表達(dá)后肝組織caspase3、核轉(zhuǎn)錄因子B(nuclear factorkappB, NFB)及HO1的變化，探討HO1對肝硬化肝臟缺血再灌注的保護(hù)機(jī)制。1 材料與方法1.1 實(shí)驗動物及分組 健康雄性SD大鼠，體重200-250g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為：正常組(N組)、硬化組(LC組)、假手術(shù)組(S組)、手術(shù)組(I/R組)和給藥組(I/R+hemin組)。正常組和硬化組：入腹后直接取血和肝組織，不阻斷肝門血供。假手術(shù)組：入腹后只分離肝十二脂腸韌帶，不

8、阻斷肝門血供。手術(shù)組：游離肝十二脂腸韌帶，分清供應(yīng)肝左葉和中葉的肝蒂，肝臟缺血30min，再灌注6h。給藥組：術(shù)前24h和12h給大鼠腹腔注射氯化鐵血紅素(hemin)，每次0.3mmol/kg(30mol/100g)，其余操作同手術(shù)組。其他各組給予等量生理鹽水腹腔注射。正常組每組6只大鼠，其余各組或亞組9-12只大鼠。1.2 主要試劑 CCl4分析純購自西安富力化學(xué)廠，橄欖油分析純購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，hemin購自美國Sigma公司，超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，抗大鼠NFBp65、caspase3和HO1一抗購自武漢博士得生物工程

9、公司，即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。1.3 模型制備1.3.1 肝硬化模型的制備 除正常組外其余各組大鼠皮下注射體積分?jǐn)?shù)為40% CCl4溶液(由2份CCl4和3份橄欖油混合而成)，首劑5mL/kg，以后每次3mL/kg；正常組大鼠皮下注射等體積生理鹽水，每周2次，共11周。隨機(jī)抽取大鼠做肝組織HE染色和Masson染色證實(shí)肝硬化形成，造模成功后1周用于實(shí)驗。1.3.2 肝臟缺血再灌注模型的制備 大鼠術(shù)前禁食12h，氯氨酮(0.8g/kg)腹腔注射麻醉大鼠，上腹正中切口，游離肝十二指腸韌帶，用無創(chuàng)微血管夾夾閉供應(yīng)肝左葉和肝中葉的肝動脈、門靜脈及

10、膽管，造成70%肝臟缺血。不阻斷肝尾葉和肝右葉血流，以防門靜脈和胃腸道淤血。30min后松開微血管夾恢復(fù)肝臟灌流，關(guān)腹后獨(dú)籠飼養(yǎng)。1.3.3 hemin溶液的配制 稱取少量hemin，溶于0.1mol/L NaOH溶液中，再用1mol/L HCl調(diào)pH至7.4，最后用生理鹽水稀釋至終質(zhì)量濃度5g/L。臨用前新鮮配制，避光保存。1.4 實(shí)驗方法1.4.1 采集標(biāo)本 各組動物實(shí)驗結(jié)束后，再次麻醉大鼠，二次開腹，取下腔靜脈血6-8mL，常溫下1500r/min離心5min，取血清低溫保存。取左葉肝組織約0.4cm0.5cm1.0cm固定于40g/L多聚甲醛溶液中，石蠟包埋，5m厚連續(xù)切片。1.4.2

11、 血清學(xué)檢查 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)由本院生化室全自動生化分析儀測定。MnSOD、MDA采用南京建成公司SOD、MDA檢測盒進(jìn)行測定。1.4.3 免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判定 肝組織石蠟切片采用即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒檢測NFB、caspase3和HO1蛋白的表達(dá)。一抗工作濃度分別為1300、1100和1100。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照，用已知陽性反應(yīng)的組織作為陽性對照。采用德國LEICA公司的QWin550CW圖像信號采集與分析系統(tǒng)對切片陽性部位進(jìn)行灰度分析，灰度值越低，表明蛋白表達(dá)量越高。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)標(biāo)

12、準(zhǔn)差(s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，以全體P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 血清ALT、AST活性測定 LC組血清ALT、AST活性較N組明顯升高(P0.01)。肝臟缺血再灌注6h后，I/R組、I/R+hemin組血清ALT、AST活性迅速升高，與S組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。I/R+hemin組與I/R組相比，酶活性降低，其差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01，表1)。2.2 血清MnSOD、MDA含量測定 與N組比較，LC組MnSOD水平降低，MDA水平升高(P0.01)。肝臟缺血再灌注后6h時I/R組及I/R+hemin組MnSOD均低

13、于S組，MDA高于S組(P0.01)，但給予hemin再灌注后MnSOD水平高于同期I/R組，MDA水平低于I/R組(P0.01,表1)。表1 肝臟缺血再灌注6h時血清學(xué)指標(biāo)（略）Table 1 The level of serum enzymes after 6h of hepatic ischemiaN: normal group; LC: liver cirrhosis group; S: shamoperation group; I/R: ischemia reperfusion group; I/R+hemin: given hemin before ischemia reperfusion group; #P0.01 vs. N group; P0.01 vs. S group; P0.01 vs. I/R group2.3 肝組織NFB、caspase3免疫組化結(jié)果 NFB、caspase3在N組肝組織中幾乎沒有表達(dá)，在LC組和S組呈弱陽性表達(dá)。肝硬化大鼠肝臟缺血再灌注后6h，I/R組NFB、caspase3表達(dá)比S組明顯升高(P0.01)。I/R+hemin組再灌注6h時NFB、caspase3表達(dá)比同期I/R組明顯下降(P0.01，表2、圖1、圖2)。2.4 肝組織HO1免疫