熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)指南

1、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)指南第一部分一、         基本步驟： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對； 2、引物、探針的設(shè)計(jì)； 3、引物探針的合成； 4、反應(yīng)體系的配制； 5、反應(yīng)條件的設(shè)定； 6、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化； 7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析； 8、標(biāo)準(zhǔn)品的制備； 二、技術(shù)關(guān)鍵：  1、 目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對； 從/網(wǎng)點(diǎn)的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開某個序列后，直接點(diǎn)擊“s

2、ave”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后，再打開DNAstar軟件中的Editseq軟件，點(diǎn)擊“file”菜單中的“import”，打開后點(diǎn)擊“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，點(diǎn)擊“file”菜單中的“open entrez sequence”，導(dǎo)入后保存為“.seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后要對所有的序列進(jìn)行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，點(diǎn)擊“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.s

3、eq”的所有文件，點(diǎn)擊“add” 或“add all”，然后點(diǎn)擊“Done”導(dǎo)入要比較的序列，再點(diǎn)擊“assemble”進(jìn)行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時(shí)要設(shè)定比較序列的開始與結(jié)尾。有時(shí)因?yàn)閰?shù)設(shè)置的原因，可能分為幾組(contig)，若想全部放在一組中進(jìn)行比較，就調(diào)整“project” 菜單下的“parameter”，在“assembling”內(nèi)的“minimum math percentage”默認(rèn)設(shè)置為80，可調(diào)低即可。再選擇幾個組，點(diǎn)擊“contig”菜單下的“reassemble contig”即

4、可。選擇高低的原則是在保證所分析的序列在一個“contig”內(nèi)的前提下，盡量提高“minimum math percentage”的值。有時(shí)因此個別序列原因，會出現(xiàn)重復(fù)序列，堿基的缺失或插入，要對“contig”的序列的排列進(jìn)行修改，確保排列是每個序列的真實(shí)且排列同源性最好的排列。然后，點(diǎn)擊“save”保存即可。分析時(shí)，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對于彌散性的紅色是不可用的。2、 引物和探針設(shè)計(jì)2.1引物設(shè)計(jì)   細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計(jì)糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其他的非目的序列。下面的指

5、導(dǎo)描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點(diǎn)： ²序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；²擴(kuò)增片段長度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別：sybr green I技術(shù)對片段長度沒有特殊要求；Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp150bp；²避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；²避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；²典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低

6、了產(chǎn)量。Tm值在5565，GC含量在40%60%； ²引物之間的TM相差避免超過2；²引物的3端避免使用堿基A；²引物的3端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。 ²為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)最好能跨兩個外顯子。 2.2  Taqman 探針設(shè)計(jì) 一般設(shè)計(jì)原則： ²探針位置盡可能地靠近上游引物；²探針長度通常在2535bp，Tm值在6570，通常比引物TM高510，GC含量在40%70%。²探針的5端應(yīng)避免使用堿基G。 ²整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。 ²為確保引物探針的特異性，

7、最好將設(shè)計(jì)好的序列在blast中核實(shí)一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計(jì)引物探針。(/BLAST) 2.3  Taqman  MGB 探針設(shè)計(jì)介紹 MGB探針的優(yōu)點(diǎn)：  ²MGB探針較短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)。  ²短片段探針(14-20bp)加上MGB后，Tm值將提高10，更容易達(dá)到熒光探針Tm值的要求。 ²MGB探針的設(shè)計(jì)原則  ²探針的5端避免出現(xiàn)G，即使探針?biāo)鉃閱蝹€堿基，與報(bào)告基團(tuán)

8、相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號。  ²用primerexpress軟件評價(jià)Tm值，Tm值應(yīng)為65-67。  ²盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于13bp。  ²盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，尤其是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。  ²原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)。因此，在進(jìn)行SNP檢測時(shí)，為了檢測到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號檢測

9、將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點(diǎn)可向3端移動，但突變位點(diǎn)至少在離3端2個堿基的前方(即必須確保探針的后兩個堿基是絕對的保守)，以進(jìn)行SNP檢測。反過來，若要進(jìn)行同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針的5端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號。另一種方法是設(shè)計(jì)簡并探針，也可達(dá)到即使是突變，仍可檢測到突變。 2.4  實(shí)時(shí)多重PCR探針的選擇： 多重實(shí)時(shí)PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的

10、染料標(biāo)記探針，在檢測時(shí)可根據(jù)熒光的顏色來判定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴(kuò)增不同長度的目的片段，反應(yīng)中加入SYBRN染料，最后根據(jù)不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。 多重實(shí)時(shí)PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：如同時(shí)為Taqman 探針、或同時(shí)為MGB探針、或同時(shí)為Beacon 探針。在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析:設(shè)計(jì)好各對引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后兩兩分別選中所設(shè)計(jì)的多重引物或兩兩分別選中所設(shè)計(jì)的多重探針后，在“report”菜單下“primer

11、 pair dimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，并對此對引物用dG值進(jìn)行評價(jià)(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。3、影響PCR及熒光PCR 的其他因素 引物的設(shè)計(jì)和選擇符合熒光PCR的探針并進(jìn)行設(shè)計(jì)對于實(shí)時(shí)熒光PCR尤其重要?？梢哉f，不合理的設(shè)計(jì)意味著絕對的失敗。但是，好的設(shè)計(jì)并不等于好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進(jìn)行介紹。  3.1 引物退火溫度 引物的一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。T

12、m對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55到70。退火溫度一般設(shè)定比引物的Tm低5。 設(shè)定Tm有幾種公式。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。所有oligo軟件會自動計(jì)算引物的Tm值。在設(shè)置退火溫度時(shí)可以如下進(jìn)行：以低于估算的Tm5作為起始的退火溫度，以2為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳結(jié)果，兩個引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5，就

13、會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5。或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下可以獲得目的模板的部分拷貝。 3.2  引物濃度 引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5M。較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了確定引物濃度，可以在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計(jì)算引物濃度。微摩消光系數(shù)可以使

14、用公式2計(jì)算。與大分子雙鏈DNA可以使用平均消光系數(shù)不同，確定引物的精確濃度必須使用計(jì)算的消光系數(shù)。這是因?yàn)橐镙^短，堿基組成差異很大。在oligo軟件上可以計(jì)算出引物的的消光系數(shù)（OD/mol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（mol/OD）。 一般商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表示量的多少，在一般情況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50M）。也可以用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/mol），計(jì)算出一定的工作濃度下，引物的加水量。濃度(M)A260（OD/ml）×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD） 舉例：計(jì)算某寡核苷酸（溶

15、于1ml水中），取其中的10l稀釋100倍（加入990l）水中。在A260處測吸光度為0.2。計(jì)算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8 nmol/OD，代入得：濃度0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）96nmol/ml96M 3.3 引物、探針的純度和穩(wěn)定性定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截?cái)嘈蛄械漠a(chǎn)生是因?yàn)镈NA合成化學(xué)的效率不是100。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時(shí)使用重復(fù)化學(xué)反應(yīng)，使DNA從3'到5'合成。在任何一個循環(huán)都可能失敗。較長的引物，尤其是大于

16、50個堿基，截?cái)嘈蛄械谋壤艽螅赡苄枰兓?。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100M。也可以用雙蒸水溶解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20。以大于10M濃度溶于TE的引物在-20可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15到30）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20保存至少1年，在室溫（15到30）最多可以保存2個月。探針即寡核苷酸進(jìn)行熒光基團(tuán)的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記以后一般應(yīng)該純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時(shí)間可以高達(dá)一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大

17、的區(qū)別。由于反復(fù)凍融易導(dǎo)致探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的情況下，最好稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。3.4  熱啟動熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如定點(diǎn)突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。限制Taq DNA聚合酶活性的常

18、用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動方法十分煩瑣，尤其是對高通量應(yīng)用。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。Transitor® Hot S

19、tart Taq酶對于自動熱啟動PCR來說高效可靠。Transitor® Hot Start Taq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴(kuò)增前，不會產(chǎn)生由于引物隨機(jī)粘連而形成的非特異性擴(kuò)增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團(tuán)會被剪切，從而釋放酶活。此外，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，酶活會被逐步釋放，有效提高擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶在變性步驟的95保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會被釋放到反應(yīng)中，從而完全恢復(fù)聚

20、合酶活性。 3.5鎂離子濃度 鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，降低了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200M dNTP的實(shí)時(shí)定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度可以增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴(kuò)增，降低忠實(shí)性。為了確定最佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，可以使用 Transitor® Hot&

21、#160;Start Taq酶。Transitor® Hot Start Taq DNA聚合酶能夠在比一般的Taq DNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范圍內(nèi)保持功能，因此僅需較少的優(yōu)化。 3.6 模板質(zhì)量 模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多種污染物會抑制PCR。一些在標(biāo)準(zhǔn)基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01時(shí)就會抑制擴(kuò)增反應(yīng)。分離基因組DNA較新的方法包括了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基質(zhì)結(jié)合，在血液

22、及其他生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進(jìn)行PCR 反應(yīng)的模板質(zhì)量，以增加PCR 反應(yīng)的成功率。 3.7 模板濃度 起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴(kuò)增和熒光PCR擴(kuò)增，104到106個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大?。ㄏ卤恚Ｅe例說，100ng到1g的人類基因組DNA，相當(dāng)于3×104到3×105個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10100ng的量就足夠檢測了。當(dāng)然對模板做

23、一個梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴(kuò)增效率。 表1. 基因組大小和分子數(shù)目的比例 基因組 DNASize(bp)*Target Molecules/µg of Genomic DNAAmount of DNA(µg) for -105 MoleculesE. coli4.7×1061.8×1080.001Saccharomyces cerevisiae2.0×1074.5×1070.01Arabidopsis thaliana7.0×1071.3×1070.01Drosophi

24、la melanogaster1.6×1086.6×1050.5Homo sapiens2.8×1093.2×1051.0Xenopus laevis2.9×1093.1×1051.01.0Mus musculus3.3×1092.7×1051.0Zea mays1.5×10106.0×1042.0pUC 18 plasmid DNA2.69×1033.4×10111×10-63.8  防止殘余（Carry-over）污染PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N

25、敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）?？梢栽赑CR過程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫φ諜z測污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨(dú)加入。一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的

26、尿嘧啶。在擴(kuò)增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開來。因?yàn)榍懊娴臄U(kuò)增產(chǎn)物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。第二部分1、 高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系 影響PCR的因素如此之多，您有時(shí)很難區(qū)分是什么導(dǎo)致您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不佳。降低實(shí)驗(yàn)的不穩(wěn)定因素是使用優(yōu)質(zhì)可靠的產(chǎn)品。 使用優(yōu)質(zhì)、性能可靠的熱啟動酶、優(yōu)質(zhì)的dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預(yù)混成的定量PCR試劑體系，最大程度的降低了反應(yīng)變量，提高了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性。您還需要進(jìn)行以下步驟的準(zhǔn)備：設(shè)計(jì)引物和探針、合成引物和探針、正確儲藏、得到

27、高質(zhì)量的模板，隨后，您僅需要進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，就能得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。    FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）同競爭對手的定量PCR體系相比提供了更優(yōu)異的結(jié)果。使用這種產(chǎn)品，您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度，同時(shí)可以靈活地選擇您所喜歡的擴(kuò)增條件，檢測方法和設(shè)備。 實(shí)時(shí)定量PCR是快速增長的PCR方法，它可以精確、可重復(fù)地定量起始物質(zhì)。FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）是一種方便使用的反

28、應(yīng)混合液，為定量分析進(jìn)行了優(yōu)化。它包含了熒光PCR所必須的成分（如緩沖液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，擴(kuò)增引物和熒光標(biāo)記探針。您就可以得到實(shí)時(shí)qPCR所需的特異性和靈活性。 您可以利用成套的hot start Taq酶 kit(A2010A0106)，來配制不含有UNG/dUTP防污染系統(tǒng)的熱啟動熒光PCR體系。 您也可以選擇hot start Taq酶，UNG酶和dNTPS,來配制含有UNG/dUTP防污染系統(tǒng)的熱啟動熒光PCR體系。 您可以從實(shí)驗(yàn)角度得到多種選擇，得到高產(chǎn)量、特異和靈活的定量PCR試劑體系！高產(chǎn)量和特異性的擴(kuò)增 F

29、Q PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）提供了強(qiáng)大的PCR擴(kuò)增，可以使用多個模板組。所使用的Taq DNA聚合酶具有熱啟動特性。這極大地降低和消除了錯誤配對和非特異性擴(kuò)增，使您得到較高產(chǎn)量，并增加特異性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止殘余污染的能力防止了非模板DNA的擴(kuò)增，從而降低了假陽性，使結(jié)果更可靠。 在產(chǎn)量和靈敏度方面，Quantitative PCR  MASTER Mix-UDG（hot start）的靈敏度極高（閾循環(huán)）。您可以更精確地定量

30、低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范圍內(nèi)檢測線性劑量反應(yīng)。 高度靈活性 除了靈敏度和特異性外，Universal PCR Master Mix Kit在分析設(shè)置，檢測方法和設(shè)備上給您提供了較高的自由度。使用Universal PCR Master Mix Kit，您可以： 對擴(kuò)增的不同模板優(yōu)化鎂離子濃度，由于提供了附加的氯化鎂，所以您可以方便地配置Mix體系。 可以更靈活的進(jìn)行普通PCR和熒光PCR。 可以在多種設(shè)備上使用，如ABI Prism® 7700, ABI&

31、#160;GeneAmp® 5700和Bio-Rad的I-Cycler。可以利用多種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)，包括TaqMan®探針和Molecular Beacon，您不必局限于特定的試劑盒。您還可以靈活的選擇進(jìn)行自配熒光PCR體系，不論是含UNG/dUTP防污染系統(tǒng)還是不含該系統(tǒng)的。2、 反應(yīng)體系配制： A2010A0101 試劑盒：（探針體系） FQ-PCR MasterMix-UNG混合物(2X) 25ul（終濃度為1×）； 上游引物（終濃度為50900nM）（可先設(shè)200 nM），下游引物（終濃度為509

32、00nM）（可先設(shè)200 nM）；探針（終濃度為200nM）；待檢樣品 5ul（終濃度為10100ng）； 無菌去離子水 補(bǔ)足，使總體積達(dá)到 50ul 。  您可以選擇熒光染料SYBGREEN體系，具體請參照說明書。 您可靈活使用20-50ul間其他體積，注意保證終濃度相同。 A2010A0106 試劑盒: 反應(yīng)體系終濃度(自配熱啟動熒光系統(tǒng))： 1-2U的hot start Taq酶、3-5.5mM的Mg2+ 、0.2mM的dNTPs、 1×PCR buffer（A2010

33、A0106）；50900nM 的上游引物（可先設(shè)200 nM）、50900nM 的下游引物（可先設(shè)200 nM）、200nM的探針、通常取2-5ul的模板, 無菌去離子水 補(bǔ)足，反應(yīng)總體積通常為2050ul 自配熱啟動熒光UNG 體系： 1-2U的Taq酶、1×PCR buffer、2.5-4.0mM的Mg2+（A2010A0105 ）；0.2-1U的UNG酶(A2010A0107)（可先設(shè)為0.5U）、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP（要調(diào)整）(A2010A010

34、8)；50900nM 的上游引物（可先設(shè)200 nM）、50900nM 的下游引物（可先設(shè)200 nM）、200nM的探針、通常取2-5ul的模板、反應(yīng)總體積通常為2050ul。3、反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化:使用高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系FQ PCR  MASTER Mix-UDG（hot start），優(yōu)化參數(shù)最少。您只需要優(yōu)化退火溫度，就可以得到更靈敏、更可靠的定量結(jié)果。對于特殊結(jié)構(gòu)的熒光PCR，您可以優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更靈敏的結(jié)果。使用通用PCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，可以適合更多的反應(yīng)體系，如

35、mRNA的普通RT-PCR檢測，適用于合成質(zhì)粒的PCR，同時(shí)也適用于熒光PCR，范圍更寬。采用成套的hot start Taq酶 kit(A2010A0106)，該試劑盒中含有進(jìn)行熱啟動熒光核心試劑盒的所有成分，也降低了選擇純度不夠或不合適產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)。您需要根據(jù)以下原則進(jìn)行優(yōu)化：1、您需要對酶量和鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化。酶的推薦反應(yīng)濃度為1.251.5 U（50ul），必要時(shí)可在1-2U之間探討酶的最佳條件；Mg離子推薦濃度普通PCR終濃度為13 mM, 熒光PCR終濃度為35.5 mM，請?jiān)谠摲秶鷥?nèi)探討最佳條件。2、試劑盒中提供的dNTP已經(jīng)預(yù)混，能夠充分保證產(chǎn)品質(zhì)量和PCR的忠實(shí)性。dNTP選

36、擇經(jīng)典的0.2mM的濃度即可。3、另外，上游引物和下游引物濃度可先設(shè)為200 nM。當(dāng)結(jié)果不理想時(shí)，可以在50nM900nM之間進(jìn)行探討。4、 如選用Taqman探針，探針濃度可設(shè)為200 nM，不須探討。選擇其他種類的探針需根據(jù)要求設(shè)置探針濃度。5、可以先用推薦的反應(yīng)條件，如果結(jié)果不佳，可根據(jù)引物、探針設(shè)計(jì)的具體情況適合的退火溫度，退火時(shí)間和循環(huán)數(shù)。6、DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時(shí)可進(jìn)行梯度稀釋，確定最佳的DNA模板添加量。如果欲進(jìn)行2 Step RT-PCR反應(yīng)的第二步PCR擴(kuò)增反應(yīng)，第一步的RT反應(yīng)液作為DNA模板時(shí)的

37、添加量不要超過PCR反應(yīng)液總體積的10%。 7、稀釋所有探針、引物或配制模板請使用無菌雙蒸水或Tris溶液。所有反應(yīng)容器應(yīng)保證無菌無酶無熱源。如進(jìn)行RNA反應(yīng)應(yīng)采用無RNA降解酶的水和容器進(jìn)行操作。如采用hot start Taq酶來配制與A2010A0101相同的熱啟動熒光體系（含UNG/dUTP防污染體系），您可以選擇A2010A0105，A2010A0107和A2010A0108進(jìn)行。與A2010A0106不同的是除了以上的優(yōu)化步驟外，還增加了對UNG/dUTP系統(tǒng)進(jìn)行探討。建議先使用A2010A0106優(yōu)化好產(chǎn)品體系后，再來優(yōu)化該防污染系統(tǒng)。0.2-1U的UNG酶(A2010A0107

38、)（可先設(shè)為0.5U）、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP (A2010A0108)。反應(yīng)條件如酶量、Mg離子等都已經(jīng)調(diào)好（參照A2010A0106）,您可以固定d(A,C,G)TPs的濃度為0.2mM，并設(shè)定UNG濃度為0.5U(50ul)，dUTP濃度也設(shè)為0.2mM，初步來看反應(yīng)結(jié)果。如結(jié)果不理想可調(diào)整dUTP濃度（上調(diào)）。直至得到滿意結(jié)果。并可進(jìn)行防污染能力測試（用含U的擴(kuò)增片斷進(jìn)行）。請參照3：影響PCR及熒光PCR 的其他因素進(jìn)行優(yōu)化?？傊?，優(yōu)化的指標(biāo)越多，實(shí)驗(yàn)的不確定性就越大。避免在操作中引入更大的不確定性和不可重復(fù)性?？蓞⒄盏腝PCR  M

39、ASTER Mix-UDG（hot start）使用注意事項(xiàng)。4、適用的熒光儀器、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；目前市場上有許多種實(shí)時(shí)PCR儀：其中包括ABI7700，ABI7900，ABI7000 (Applied Biosystems)；MX4000 (Stratagene)；iCycler (Bio-Rad)；Smartcycler(Cepheid)；Robocycler (MJ Research)；Lightcycler (Roche)；ROTORGENE(CORBERT) ；杭州博日（Linegene）。不同的儀器使用方法有所區(qū)別，但都具備對Taqman 探針和sybgreen 染料

40、法的檢測波長和檢測能力。QPCR  MASTER Mix-UDG（hot start）和通用PCR Master Mix均適合在這些儀器上進(jìn)行使用。為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的有效性，每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)陰性對照和4個標(biāo)準(zhǔn)品，每個樣品都平行做2個復(fù)孔?；€或閥值的設(shè)定 通常是以1015個循環(huán)的熒光值作為閥值，也可以以陰性對照熒光值的最高點(diǎn)作為基線。問 題可能原因建議解決方法定量PCR 無擴(kuò)增產(chǎn)量或很少的擴(kuò)增產(chǎn)量DNA模板質(zhì)量不好，含有抑制劑提高模板質(zhì)量，諸如DMSO，SDS和甲酰胺之類的試劑會抑制Taq DNA聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNAPCR引物設(shè)計(jì)較差避免在引物3'端

41、含有互補(bǔ)序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計(jì)Tm類似的引物。探針設(shè)計(jì)較差對探針序列進(jìn)行blast比對，設(shè)計(jì)符合要求的探針PCR引物合成較差用普通電泳法，看引物的設(shè)計(jì)和合成質(zhì)量，是否有目的條帶出現(xiàn)。熒光探針無功能確保探針設(shè)計(jì)的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase處理TaqMan探針，校驗(yàn)熒光是否增強(qiáng)。必要的話設(shè)計(jì)和合成探針。模板濃度太低使用104拷貝的靶序列，以在25到30個循環(huán)中獲得信號。鎂離子濃度太低從3mM到5mM，間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應(yīng)，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。FQ-PCR MasterMix-UNG 試劑盒不需優(yōu)化鎂離子濃度

42、。引物濃度太低最佳引物濃度介于0.1M到0.5M之間。為了精確確定引物濃度，在260nm測量光密度，然后使用光吸收值和消光系數(shù)計(jì)算濃度。（見公式1）選擇優(yōu)質(zhì)酶進(jìn)行擴(kuò)增選擇hot start Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增，可提高靈敏度，增加產(chǎn)量，降低干擾因素退火溫度太高使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設(shè)定為低于Tm 5。因?yàn)檫@些公式只是估算Tm值，所有真正的退火溫度實(shí)際會高些或低些。反應(yīng)物中有不明物干擾在各個反應(yīng)物中存在不明物質(zhì)對PCR進(jìn)行干擾，對任何實(shí)驗(yàn)樣品或試劑，均應(yīng)采用無菌無酶無熱源的離心管進(jìn)行試劑的分裝和使用。定量PCR陽性對照無擴(kuò)增曲線（針對：已經(jīng)優(yōu)化好的體系）引物、探針設(shè)計(jì)合格；原來合成質(zhì)量已

43、經(jīng)驗(yàn)證。需確認(rèn)：反應(yīng)成分是否漏加；確定反應(yīng)條件是否合適；正常標(biāo)本是否能擴(kuò)增來判斷是對照的問題還是體系的問題；確認(rèn)體系：1、引物是否降解（看擴(kuò)增產(chǎn)物是否可電泳出）來判斷引物和酶功能；2、探針是否降解（用DNase處理TaqMan探針，校驗(yàn)熒光是否增強(qiáng)）。儀器是否正常工作 定量PCR陰性對照一直有擴(kuò)增曲線模板或PCR殘余污染隔離污染來源，更換試劑。使用UNG/dUTP防污染系統(tǒng)。使用專用的精致移液器。在無DNA區(qū)域準(zhǔn)備反應(yīng)，使用抗氣溶膠的吸頭。體系有問題酶濃度不對，Mg離子濃度不對定量PCR（染料法）出現(xiàn)非特異信號引物二聚體多檢查引物設(shè)計(jì)和合成環(huán)節(jié)，必要時(shí)更改引物更換熱啟動酶熱啟動酶能增加反應(yīng)的特異性，提高靈敏度設(shè)定檢測信號時(shí)的溫度在更高的溫度下檢測熒光信號（此時(shí)引物二聚體已經(jīng)解鏈）定量RT-PCR無擴(kuò)增產(chǎn)量相對熒光信號小于等于背景或沒有模板對照無cDNA合成 cDNA合成溫度太高降低保溫溫度反轉(zhuǎn)錄cDNA產(chǎn)物被二級結(jié)構(gòu)封閉提高保溫溫度。重新設(shè)計(jì)引物RNA被損害或降解必要的話更換RNARNAse污染維持無菌條件；加入RNase抑制劑熒光探針無功能確保探針設(shè)計(jì)的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase處理