蛋白質(zhì)組學(xué)在骨關(guān)節(jié)疾病研究中的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)組學(xué)在骨關(guān)節(jié)疾病研究中的應(yīng)用         10-05-05 11:32:00     作者：梁曉南，趙勁民     編輯：studa20【關(guān)鍵詞】  蛋白質(zhì)    蛋白質(zhì)作為細(xì)胞中的活性大分子，其表達(dá)水平的改變與疾病、藥物作用或毒素作用直接相關(guān)。蛋白質(zhì)組學(xué)的理論和技術(shù)的發(fā)展與完善使人們從組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)整體水平去認(rèn)識(shí)疾病成為可能。這一技術(shù)將是發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志物、鑒定和評(píng)價(jià)藥物靶蛋白等十分有

2、用的工具。    1  蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及研究意義    蛋白質(zhì)組(Proteome)與蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)的提出至今已有10年左右的時(shí)間。蛋白質(zhì)組一詞，源于蛋白質(zhì)(protein)與基因組(genome)兩個(gè)詞的雜合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念，在同一個(gè)機(jī)體的不同組織和細(xì)胞中不相同，在同一機(jī)體的不同發(fā)育階段，不同的生理狀態(tài)下，乃至不同的外界環(huán)境下也不相同。各種復(fù)雜的生命活動(dòng)，都是特定蛋白質(zhì)群體在不同時(shí)間和空間不同組合的結(jié)果。&#

3、160;   蛋白質(zhì)組學(xué)則是大規(guī)模、系統(tǒng)地在蛋白質(zhì)組整體水平進(jìn)行研究的一門(mén)新興學(xué)科1，包括研究細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平和翻譯后修飾狀態(tài)、蛋白質(zhì)之間的相互作用和聯(lián)系。蛋白質(zhì)組學(xué)可分為比較蛋白質(zhì)組學(xué)和表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)2。前者通過(guò)比較分析不同生理、病理?xiàng)l件下細(xì)胞、組織或體液中表達(dá)的蛋白質(zhì)異同，篩選出許多具有臨床標(biāo)志意義的蛋白質(zhì)關(guān)鍵分子。后者目的在于建立蛋白質(zhì)表達(dá)譜和修飾譜的數(shù)據(jù)庫(kù)、細(xì)胞定位圖、蛋白質(zhì)作用連鎖圖，探索和闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)。將蛋白質(zhì)組表達(dá)信息與基因組信息有效結(jié)合，這既可顯示蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾方式，又可克服分離蛋白質(zhì)與理論蛋白質(zhì)不一致的局限，從而使病理生

4、理機(jī)制的解釋更為完全和準(zhǔn)確。    2  骨關(guān)節(jié)疾病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究    各類(lèi)骨關(guān)節(jié)疾病，包括退行性關(guān)節(jié)炎、滑囊炎、滑膜炎、肩周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、股骨頭壞死等，都是較難治愈的慢性疾患，患病后關(guān)節(jié)腫、痛、積液、僵直、增生、骨刺，活動(dòng)艱難甚至導(dǎo)致殘疾!蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展將極大的促進(jìn)骨關(guān)節(jié)疾病的研究，雖然目前還處于起步階段，但從基因組向蛋白質(zhì)組方向轉(zhuǎn)變不失為今后骨關(guān)節(jié)疾病研究的一種新模式。    2.1  骨細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)組研究  間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchym

5、al stem cells，MSCs)是一群具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化能力的干細(xì)胞，為骨組織的修復(fù)與替代提供了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域，但有關(guān)MSCs定向分化的分子機(jī)制尚不清楚。Seshi3應(yīng)用熒光差異凝膠電泳(difference gel electrophoresis，DIGE)對(duì)正常與白血病患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究，在pH 4.67.0范圍內(nèi)檢測(cè)出約5000個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，隨后應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MSMS)鑒定出128個(gè)差異蛋白，其中

6、72個(gè)差異蛋白在白血病患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)增高或降低1.25倍以上。Foster等4運(yùn)用MS方法比較得出人MSCs定向成骨細(xì)胞分化前、后的463個(gè)蛋白，包括已知的人MSCs細(xì)胞表面抗原(CD71、CDl05、CDl66等)，膜相關(guān)蛋白，細(xì)胞黏附分子和受體等。其中成骨細(xì)胞分化前有83個(gè)蛋白表達(dá)增高2倍以上，有21個(gè)蛋白表達(dá)下降2倍以上。劉元林等5采用定向成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)體系誘導(dǎo)MSCs定向成骨細(xì)胞分化，對(duì)未分化與分化后的MSCs細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，經(jīng)雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)找到38個(gè)蛋白差異點(diǎn)，基質(zhì)輔助激光解析電離飛

7、行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鑒定出23個(gè)差異蛋白分子表達(dá)。Zhang等6經(jīng)一系列培養(yǎng)誘導(dǎo)hMSC分化為成骨細(xì)胞，在前37 d hMSC與成骨細(xì)胞的蛋白表譜類(lèi)似，運(yùn)用2-DE檢測(cè)出102個(gè)表達(dá)改變2倍以上的蛋白斑點(diǎn)，MALDI-TOF-MS鑒定出52個(gè)差異表達(dá)蛋白。涉及新陳代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)換、核酸復(fù)制、鈣結(jié)合蛋白、蛋白折疊等。這一研究為闡明成骨細(xì)胞分化的整個(gè)蛋白表達(dá)情況提供了很好的基礎(chǔ)?？梢?jiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)方法可用于高通量篩選、研究M

8、SCs定向分化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)可能具有調(diào)控作用的重要蛋白分子。另有研究者7對(duì)滑膜細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，鑒定滑膜細(xì)胞類(lèi)型后提取蛋白進(jìn)行2-DE分離，比較類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)與骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)蛋白酪氨酸磷酸化狀態(tài)的差異。結(jié)果顯示FLS蛋白酪氨酸磷酸化在RA較OA明顯增多，其中以相對(duì)分子質(zhì)量42×10395×103間蛋白酪氨酸磷酸化位點(diǎn)居多，兩者具有非常顯著性差異。Dasuri等8也對(duì)RA患者滑膜液中的FLS進(jìn)行研究，通過(guò)2-DE和

9、MS已識(shí)別鑒定出254種蛋白質(zhì)。Dotzlaw等9通過(guò)比較健康人和RA患者的外周血單核細(xì)胞的蛋白質(zhì)2-DE圖譜發(fā)現(xiàn)，18種蛋白質(zhì)在RA患者中表達(dá)高于健康人2倍或更多。同時(shí)發(fā)現(xiàn)11種蛋白質(zhì)在健康人(對(duì)照組)中表達(dá)高于RA患者2倍或更多。這些表達(dá)不同的蛋白質(zhì)經(jīng)MALDI-TOF-MS法鑒定，其中有一些過(guò)去已被顯示在RA的發(fā)病機(jī)制有潛在的作用，因而認(rèn)為這樣的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜的比較可能具有診斷學(xué)價(jià)值。Catterall10發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞分泌的蛋白聚糖(proteoglycans，PGs)和葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)對(duì)2DE聚焦有明顯的干擾，在運(yùn)用不同方法去除GAG影響后，行

10、2DE并結(jié)合電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry，  ESI-MS)，對(duì)IL-1和制瘤素M刺激軟骨細(xì)胞分泌蛋白的改變進(jìn)行研究，鑒定出8個(gè)有意義的蛋白。該研究者認(rèn)為蛋白質(zhì)組學(xué)方法為研究軟骨細(xì)胞分泌蛋白提供了更有價(jià)值的蛋白質(zhì)加工相關(guān)信息。    2.2  血清和骨關(guān)節(jié)液的蛋白質(zhì)組研究  血液樣本信息含量十分豐富，標(biāo)本易于采集，是蛋白組學(xué)主要的研究對(duì)象。因此，利用血液標(biāo)本作骨關(guān)節(jié)相關(guān)疾病的研究較多。Xiang等11對(duì)OA和RA血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，找到19個(gè)差異蛋白質(zhì)，其中一個(gè)被

11、鑒定為磷酸丙糖異構(gòu)酶(triose phosphate isomerase，TPl)，認(rèn)為對(duì)TPI的自身抗體有可能被用作為OA的診斷標(biāo)志物。Tan等12應(yīng)用2-DE結(jié)合MALDI-TOFMS分析方法，對(duì)股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)和正常人血清蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了比較，找到7個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，然后進(jìn)一步應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)定6個(gè)差異蛋白在ONFH，OA、RA和骨折病人血清中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4個(gè)差異蛋白在ONFH與其他3種病例中的表達(dá)有區(qū)別。Saulot等13應(yīng)用2-DE和MS及免疫印跡方法(其所用抗原為重組蛋白)研究255例患有早期關(guān)節(jié)炎

12、的患者(145例RA患者、70例非RA風(fēng)濕性疾病患者和40例未定性關(guān)節(jié)炎患者)的血清，發(fā)現(xiàn)抗11-烯醇化酶的自身抗體存在于早期RA患者的血清，此抗體對(duì)RA可能具有診斷和預(yù)后價(jià)值。對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨損傷性疾病，由于任何軟骨源性標(biāo)志物分子在血清中的濃度不可能客觀地反映某個(gè)指定關(guān)節(jié)軟骨損傷的改變，因此關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)志物血清濃度與特定關(guān)節(jié)間存在嚴(yán)重的局限性，而檢測(cè)指定關(guān)節(jié)滑液將可能解決這一問(wèn)題。Sinz等14應(yīng)用2-DE和MS研究RA、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎和OA患者的血漿及滑膜液的蛋白質(zhì)表達(dá)情況，結(jié)果顯示鈣粒蛋白B僅在RA患者的滑膜液中表達(dá)，血清淀粉樣A蛋白在RA患者的滑膜液和血漿中均可檢測(cè)到，但在OA患者中未檢測(cè)到。

13、Robinson等15用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)比較RA和OA患者的滑膜液蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn)許多可用于鑒別診斷的候選生物標(biāo)志物，其中，相對(duì)分子質(zhì)量為10 850的蛋白質(zhì)峰是RA中表達(dá)比較明顯的標(biāo)志物。Drynaa等16應(yīng)用2-DE結(jié)合MS分析方法分析和鑒定了RA患者和OA患者的血漿及滑膜液的蛋白質(zhì)，結(jié)果是鈣結(jié)合蛋白A9(S100Ag)被鑒定為滑膜液中明顯的標(biāo)志蛋白。隨后通過(guò)應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)定了RA、OA及其他炎癥性關(guān)節(jié)疾病患者的血漿和滑膜液中鈣結(jié)合蛋白A8A9(S100A8A9)雜絡(luò)物的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S100A8A9雜絡(luò)物的血漿水平和滑膜液中的水平相關(guān)性很好。因此，測(cè)定血漿中的S100A8A9雜絡(luò)物可以

14、用來(lái)區(qū)分RA患者與其他炎癥性關(guān)節(jié)病患者(包括OA患者及正常對(duì)照組)。楊波等17建立了正常組、牛II型膠原與完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜的的2DE圖譜，平均點(diǎn)數(shù)為(10 204±40)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。應(yīng)用MALDI-TOF-MS鑒定兩組滑膜差異表達(dá)大于2倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)35個(gè)。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能涉及物質(zhì)代謝、能量產(chǎn)生、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、抗氧化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞骨架蛋白，它們可能以不同的方式參與了病變過(guò)程，為揭示CIA滑膜病變的機(jī)制及RA的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。而且用蛋白免疫印跡法(western blotti

15、ng)進(jìn)行膜聯(lián)蛋白I(annexin l)、醛縮酶A(aldolase A)的表達(dá)驗(yàn)證與2-DE結(jié)果一致，表明Annexin l aldolase A可能與CIA的關(guān)節(jié)滑膜病變有關(guān)。     10-05-05 11:32:00     作者：梁曉南，趙勁民     編輯：studa20    血液標(biāo)本易獲取，但其中蛋白質(zhì)組成成分異常復(fù)雜，并且高、低豐度蛋白質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)范圍非常寬(可達(dá)到1010數(shù)量級(jí))。在如此復(fù)雜的血液蛋白質(zhì)組中，必須采用合理步驟

16、盡量去除白蛋白和免疫球蛋白等高豐度蛋白質(zhì)，這樣才可以實(shí)現(xiàn)富集低豐度蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)中的候選標(biāo)志物。骨關(guān)節(jié)液體如滑液，其標(biāo)志物分子比血清標(biāo)志物更能客觀地反映所檢測(cè)關(guān)節(jié)的病變情況，但是滑液難獲取且濃度也受諸多因素的影響，如改變同時(shí)出現(xiàn)在炎癥或關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)之后，故難以得到精確的數(shù)據(jù)。每種標(biāo)本各有利弊，在臨床實(shí)踐中到底采取哪種方法進(jìn)行相關(guān)研究應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況而定。    2.3  骨組織水平的蛋白質(zhì)組學(xué)研究  劉建仁等18建立大鼠激素性骨壞死模型，分別提取正常組、激素性骨壞死組和中藥治療組的大鼠股骨和肱骨組織的總蛋白，進(jìn)行2-DE和MALDI-TOF

17、-MS質(zhì)譜分析，鑒定出3個(gè)差異蛋白，分別為阻凝蛋白重鏈B、磷脂谷胱甘肽過(guò)氧分酶及泛素化酶E2(MW：17 kd)，初步認(rèn)為這三種蛋白質(zhì)在激素性骨壞死的發(fā)病及中藥治療過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。骨組織是一種比較特殊的生物標(biāo)本，又是研究骨關(guān)節(jié)疾病必不可少的實(shí)驗(yàn)材料，因此，骨組織蛋白提取方法的優(yōu)化對(duì)于骨組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。Jiang19等首先將狗顱骨組織用鹽酸溶液溶解，然后通過(guò)3種不同提取液提取蛋白，將鹽酸溶液與提取液中的蛋白收集起來(lái)行二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(two-dimensional，high-performance liquid chromatography-tandem mass

18、spectrometry，2D-LC-MSMS)，鑒定出2 479個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中包括40種骨特有蛋白和15種潛在的蛋白生物標(biāo)志物。這一方法大大提高了骨組織蛋白的提取效率。然而目前以骨組織為樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道仍較少，而對(duì)于軟骨組織的研究則相對(duì)較多。Hermgansson等20對(duì)12個(gè)OA患者不同關(guān)節(jié)(膝、髖、肩)和14個(gè)非OA者的軟骨組織進(jìn)行培養(yǎng)，在對(duì)軟骨細(xì)胞分泌的PGs運(yùn)用沉淀法去除后進(jìn)行2-DE，50100個(gè)結(jié)合了放射性標(biāo)記物的蛋白點(diǎn)被檢測(cè)，MS鑒定出的19個(gè)差異蛋白。其中H型膠原復(fù)合物在OA軟骨組織中表達(dá)明顯上調(diào)，相對(duì)于嬰兒和青少年，成人非OA軟骨組織中該蛋白幾乎無(wú)表達(dá)。研

19、究者認(rèn)為H型膠原復(fù)合物在成熟骨骼中表達(dá)下調(diào)，而當(dāng)發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎時(shí)將被再活化起到修復(fù)軟骨的作用。Frederic等21將3名關(guān)節(jié)置換者捐獻(xiàn)的新鮮軟骨組織，經(jīng)過(guò)切割、絞碎后用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后收集培養(yǎng)物進(jìn)行2-DE和串聯(lián)質(zhì)譜，鑒定出43個(gè)蛋白，部分是已有報(bào)道的軟骨細(xì)胞分泌蛋白，如YKL-39、骨保護(hù)素等；部分未在軟骨細(xì)胞相關(guān)研究中報(bào)道，如血清淀粉樣P物質(zhì)，維生素D結(jié)合蛋白，血小板生成素，纖維蛋白素原，血管生成因子，肌動(dòng)蛋白等。該研究者認(rèn)為對(duì)于系統(tǒng)研究人骨關(guān)節(jié)炎軟骨分泌或釋放的蛋白，尋找到新的診斷標(biāo)記物，蛋白質(zhì)組學(xué)方法無(wú)疑提供了一種有力工具。軟骨組織中豐富的PGs和膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)2-D

20、E聚焦和小分子蛋白的檢測(cè)有影響。Vincourt等22利用基質(zhì)的生物學(xué)特性改進(jìn)傳統(tǒng)方法進(jìn)行軟骨組織蛋白提取，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中盡量保持基質(zhì)的原始狀態(tài)避免機(jī)械浸出，將軟骨組織在低溫(-30)切片機(jī)上切割成10 m左右大小，同時(shí)在提取液中加入高濃度氯化鈉(不超過(guò)500 mmol/L)，在膠原交聯(lián)狀態(tài)下促使軟骨組織其他組分溶解，并且采用環(huán)丙基甲醇(cyclopropyl-carbinol，CPC)選擇性沉降法去除PGs。但因CPC是離子型去垢劑，也會(huì)影響聚焦，因此最后用甲醇氯仿在室溫下沉淀純化提取物中的CPC，同時(shí)也去除了核酸和脂質(zhì)。在采用改進(jìn)方法提取軟骨組織蛋白后進(jìn)行2-DE和銀染，獲得了600多個(gè)蛋白斑

21、點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定出127種不同功能蛋白質(zhì)。由此可見(jiàn)，通過(guò)改進(jìn)獲得快速、有效、恰當(dāng)?shù)能浌羌肮墙M織蛋白提取方法，將有利于骨組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究。    3  結(jié)語(yǔ)    蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)的建立為骨關(guān)節(jié)疾病的研究提供了一個(gè)新的契機(jī)。但由于病因不清、病程緩解與復(fù)發(fā)交替的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程和復(fù)雜的臨床分型，給研究增加了難度。因此，該技術(shù)在這一領(lǐng)域的應(yīng)用目前還處于比較膚淺的階段，主要用于蛋白質(zhì)組表達(dá)模式分析，真正涉及功能蛋白質(zhì)組的研究還很少，與實(shí)際應(yīng)用的差距則更遠(yuǎn)。相信在骨關(guān)節(jié)疾病專(zhuān)家與基礎(chǔ)和應(yīng)用基礎(chǔ)科學(xué)家的共同努力下，蛋白

22、質(zhì)組學(xué)在骨關(guān)節(jié)疾病研究領(lǐng)域?qū)⒂惺謴V闊的應(yīng)用前景?？梢灶A(yù)見(jiàn)，隨著方法的不斷改進(jìn)與研究的不斷深入，今后將能借助作為骨關(guān)節(jié)疾病診斷的一組或一群蛋白質(zhì)標(biāo)志物，來(lái)進(jìn)行臨床的協(xié)助診斷。【參考文獻(xiàn)】  1 Aebersold R, Mann M. Mass spectrometry-based proteomicsJ. Nature, 2003,422: 198-207.2 Hille JM, Freed AL, Watzig H, et al.Possibilities to improve automation, speed and precision of proteome analysi

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