表面等離子體共振技術在藥物研究中的應用

1、 文章編號 :1004-0374(201009-0941-05收稿日期 :2010-04-02; 修回日期 :2010-06-10基金項目 :國家自然科學基金項目 (81001595 ;中央 民族大學自主科研項目 (0910KYQN67表面等離子體共振技術在藥物研究中的應用申剛義 *,高妍,劉越,佘東來,谷雨龍,崔箭(中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院 , 中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學教育部重點實驗室,北京 100081摘要 :表面等離子體共振 (surface plasmon resonance, SPR 技術作為一種新型的免標記、實時在線研究生物分子間相互作用的高靈敏傳感技術,已經在生命科學領

2、域中得到了大量應用。該文簡要介紹了 SPR 生物傳感器的基本原理,重點評述了其在新藥篩選和藥物作用機制方面的研究進展,并對其前景進 行了展望。關鍵詞 :表面等離子體共振;藥物研究;進展 中圖分類號 :R969.2 文獻標識碼 :AThe application of surface plasmon resonance technologyin drug researchSHEN Gang-yi*, GAO Yan, LIU Yue, SHE Dong-lai, GU Yu-long, CUI Jian(Key Laboratory of Chinese Minority Traditional

3、 Medicine, Ministry of Education of China,Institute of Chinese Minority Traditional Medicine, Minzu University of China, Beijing 100081, ChinaAbstract: As a new label-free, real-time sensor technology with high sensitivity to research biomolecularinteractions, surface plasmon resonance(SPR has been

4、widely used in the field of life science. In this review,the basic principle of SPR biosensor was introduced briefly, and its application in drug research including drugscreening and the mechanism of drug action was also reviewed in detail.Key words: surface plasmon resonance; drug research; review近

5、年來,隨著分子生物學的飛速發(fā)展,人們 對藥物的研究逐漸從宏觀的器官水平進入到了微觀 分子水平,開展了藥物與特定細胞受體蛋白、關鍵 基因、蛋白酶等與疾病相關生物分子之間的相互作 用研究 1-3。通過研究藥物與生物大分子之間特異性 相互作用,可以全程動態(tài)追蹤藥物與生命體內分子 靶點的特異性作用過程,為新藥篩選、藥物在生物 體內的作用機制提供依據(jù),進而研發(fā)制備各種新型 高選擇性的分子靶向藥物 4。而表面等離子體共振 (surface plasmon resonance, SPR 生物傳感技術的 出現(xiàn),則為這一研究提供了很好的契機。 SPR 作為 一種新型靈敏度極高的免標記、高通量、低耗量、 無損檢測

6、生物傳感技術,是當前研究分子相互作用 最重要的方法手段之一 5-8,可以實時動態(tài)研究各種 分子相互作用的整個過程,在藥物研究各個領域有非常廣泛的應用前景。本文就 SPR 技術在藥物研究 中的最新應用與發(fā)展做一簡要綜述。1 SPR 技術的基本原理及發(fā)展歷程SPR 是一種表面物理光學現(xiàn)象 9。當一束 p-偏 振光以一定的入射角度從光密介質向光疏介質傳播 時,若入射角大于臨界角,則在兩種介質的界面處 發(fā)生全內反射。入射光的電磁場部分進入到光疏介 質中,形成消逝波。如果在光密介質 (玻璃棱鏡 和 光疏介質 (分析物 的界面加一層高反射的金屬薄膜,942生命科學 第 22卷當 p-偏振光透過玻璃照射到金

7、屬薄膜表面并發(fā)生全 反射時,會導致金屬表面的自由電子被激發(fā),形成 表面等離子體。在滿足一定條件時,表面等離子體將和消逝波 的能量耦合,發(fā)生共振,導致入射光能量被吸收, 反射光強度瞬間衰減,反射率顯著減少?；诓煌?樣品折射率的不同, 會引起共振角度 (入射光波長固 定 或共振波長 (入射光角度固定 變化的原理,可對 樣品進行定性、定量分析。SPR 現(xiàn)象雖然早在 1902年就被 Wood 10發(fā)現(xiàn), 但真正被重視并迅速發(fā)展是在 20世紀末期。 1983年, Liedberg 等 11首次將 SPR技術用于生化分析。 1990年, Pha r ma ci a (現(xiàn)為 GE 首次推出商品化 Biac

8、ore 系列儀器, 并發(fā)展形成了生物分子相互作用 分析技術 (biomolecular interaction analysis。國內外 學者,在 SPR 方法技術、應用和商品化儀器研制 方面做出了重要貢獻 12-15。SPR 的分析流程一般是先將要研究的靶標分子 (配體或靶標 固定在金屬膜表面,構筑成傳感芯 片。然后使篩選的目標物 (分析物 流過傳感芯片與 靶標作用 16。基于兩種分子作用的強弱將引起芯片 表面折射率的變化,從而造成共振角或波長的變 化。依據(jù)這種變化,可實時、動態(tài)監(jiān)測分子相互 作用的整個過程,如圖 1所示 5。與傳統(tǒng)的分析方法或手段相比, SPR 技術具有 如下顯著特點:(1

9、免標記檢測:SPR 技術不需要對 樣品進行標記或者衍生化就可以進行檢測。這樣既 可保持被檢測分子的性質和狀態(tài),又避免了標記過 程及其造成的假陽信號等不利影響。 (2實時動態(tài)分 析:能動態(tài)地監(jiān)測生物分子相互作用的過程,獲得 相互作用的反應速率及動力學方程。 (3非破壞性檢 測:檢測過程不會對樣品產生任何化學或物理破 壞,屬于無損分析方法。 (4 高選擇、高靈敏性:利用各種特異性識別 (生物識別、化學和物理識別 作用,不需要對樣品進行純化或其他預處理就可直 接進行檢測。 (5檢測范圍大:SPR 技術分析的對象 很廣,從相對分子質量很小的氣體 (如氮氣、氧氣 到幾十萬相對分子質量的生物大分子 (如蛋

10、白質 再到 細胞都可研究。基于以上特點, SPR 生物傳感技術在與現(xiàn)代生 命科學相關的各個領域,如基因組學、蛋白質組 學、結構生物學、藥學等諸多領域都得到了廣泛應 用 9,16。在藥學領域中, SPR 技術在藥物篩選、激 活劑和抑制劑的優(yōu)化與選擇、信號通路、抗體篩選 等研究中都有重要應用,已成為當前生命科學和藥 物研究上的標準方法 13。2表面等離子體共振技術在藥物研究中的應用藥物研究過程中,以藥物篩選和藥物作用機制 研究尤為關鍵。藥物篩選是主動尋找新藥的過程, 是新藥發(fā)現(xiàn)的基本方式。傳統(tǒng)的藥學研究方法以藥 效學作為觀察指標進行藥物篩選,有兩個重要的制 圖 1 SPR技術實時檢測相互作用動力學

11、過程的示意圖 5943第 9期 申剛義,等:表面等離子體共振技術在藥物研究中的應用約環(huán)節(jié):一是發(fā)現(xiàn)新藥的周期長、效率低、規(guī)模 小、成本高、耗時長,嚴重制約了新藥發(fā)展的速 度;二是機制研究難度大,往往需要進行大量的探 索工作,以認識藥物的藥效學、藥物代謝動力學、 毒理學等大量內容 17。SPR 的技術優(yōu)勢為解決這些問題提供了非?？?捷的方法。應用 SPR 技術可通過監(jiān)測化合物和靶標 的親和力作用大小來快速篩選先導化合物,既無需 對樣品標記衍生,也不會損壞樣品。同時還可動態(tài) 進行藥物作用機制研究,獲得足夠的關于分子結合 親和力、動力學的相關數(shù)據(jù),并給出結合位點的信 息,為藥物研究和創(chuàng)制奠定可靠的實

12、驗數(shù)據(jù)。 2.1新藥篩選SPR 傳感技術具有免標記、低耗量、分析速 度快等優(yōu)點,可用于活性物質的快速篩選,大大加 快了新藥的篩選周期。陳莉莉等 18利用商品化的 SPR 儀 Biacore S51,不但實現(xiàn)了每天 400個活性化 合物的快速篩選,而且得到了結合和解離的定性數(shù) 據(jù)及結合穩(wěn)定性圖表。 親環(huán)素 A 是一種可以與 HIV-1相互作用并提高病毒感染性的物質, Chen 等 19利 用 SPR 技術研究了虛擬篩選出的親環(huán)素 A 的 12個小 分子抑制劑對異構酶活性和 HIV-1復制的抑制作 用,為開發(fā)抗 HIV-1的新藥奠定了基礎。腫瘤靶向 藥物的篩選是當前分子藥物研發(fā)的熱點,而表皮生 長

13、因子受體 (EGFR則是理想的分子靶點。 相對其他 技術, SPR 耗量小、實時動態(tài)檢測、結果真實可 靠的篩選模式更為突出。鄧宏偉等 20基于計算機模 擬篩選技術預測了 7個潛在的靶向分子,利用 SPR 技術進行了實際樣品的體外實驗,篩選確認了一種 高效率靶向于 EGFR 的全新小分子 NSC51186。 2.2藥物作用機制研究藥物作用機制包括藥代動力學、藥物結合位點 等。 SPR 技術由于無需標記、可實時檢測藥物作 用,能夠方便地提供結合速率常數(shù)、解離速率常數(shù) 和解離平衡常數(shù),綜合考慮可獲得藥物與作用靶點 的結合強弱和特異性信息,并能給出動力學和熱力 學數(shù)據(jù)。人血清白蛋白 (HSA是最豐富的

14、血漿蛋白,當 藥物分子進入人體后, 可與 HSA 產生不同程度的結 合,這種結合將影響藥物的配置及藥理作用,對藥 效學和藥代動力學起著重要的作用 21。 Frostell-Karlsson 等 22以 HSA 為配體構筑成靶標,利用 SPR 技術研究了 19種藥物與 HSA 的相互作用。按照結 合力的強弱將它們分為高、中、低三個等級,還 證明了 10種藥物與 酸性糖蛋白 (AGP的結合作 用。田媛等 21利用自行設計并組裝的波長掃描型 SPR 傳感器裝置,研究了兩種頭孢菌素類藥物頭孢 克洛和頭孢曲松與 HSA 的相互作用, 并得到了結合 常數(shù)和結合百分率, 結合常數(shù)分別為 1.17×

15、103 L/mol和 2.55×102 L/mol,結合百分率分別為 44.22%和 14.79%。楊帆和楊秀榮 23利用 SPR 技術,對脂多 糖與 血 液 蛋白質、溶菌酶和殼聚糖等幾種生物分 子之間的相互作用進行了動力學分析。發(fā)現(xiàn)除了鐵 蛋白以外,脂多糖與人血清白蛋白、血紅蛋白、殼 聚糖、溶 菌 酶 均 有 很 強 的 結 合 作 用 , 親 和 常 數(shù) 分別為 2.36×107、 2.03×108、 7.58×106和 2.82×104 L/mol。SPR 方法還能為藥物構效關系提供有效的動力 學數(shù)據(jù)。 腺苷酸環(huán)化酶外毒素水腫因子 (EF

16、和 CyaA 是兩種分別產自炭疽病和百日咳的病原菌的外毒 素。 Soelaiman 等 24利用 SPR 生物傳感技術篩選了 一種競爭性的抑制劑喹喔啉。它能與 ATP 上的腺嘌 呤競爭在 EF 上的結合位點,而不影響鈣調蛋白與 EF 的結合。 Choulier 等 25采用 Biacore 的商品儀,通 過 QSAR 方法研究了抗原 -抗體兩種分子相互作用的 動力學。通過比較解離常數(shù)獲得了結構 -動力學信 息,為優(yōu)化分子相互作用動力學和 SPR 技術在藥理 學中的應用拓展了思路。儀器技術的改進大大提高了 SPR 技術的應用范 圍,利用商品化的 SPR 技術也可以高靈敏地檢測生 物大分子與小分子

17、藥物 (相對分子質量 0.2 k之間 的相互作用。例如, Myszka 26采用 Biacore S51研 究了碳酸酐同工酶 II (CA II 與小分子化合物磺胺衍 生物抑制劑的活性關系。如圖 2所示,可以非常靈 敏地測出 CA II 酶與相對分子質量為 0.1572 k的苯 磺胺的作用常數(shù)。同樣, Bravman 等 7則基于 XPR36圖 2 苯磺胺與 CA II 酶的相互作用 26944生命科學 第 22卷儀,采用“一步法”方法高通量研究了 CA II和 9種 磺胺類小分子的結合動力學。與臨床上常用的檢測方法酶聯(lián)免疫法 (ELISA和 放射免疫法 (RIA等相比, SPR 技術樣品處理

18、簡單、 耗樣量少、實時監(jiān)測、免標記的特性更具優(yōu)勢。西 妥昔單克隆抗體是一類以 EGFR 為靶點設計的治療 藥物。稅雪等 27利用 SPR 技術研究了國產西妥昔單 克隆抗體 C225與可溶性重組人 EGFR 的結合能力, 并與國外的西妥昔單抗 Erbitux 相比較,發(fā)現(xiàn) C225與 Erbitux 有相似的結合動力學特性, 建立了較為成 熟的進行藥代動力學定量分析研究的方法,而且該 方法的檢測靈敏度與 ELISA 水平相同。凌燕等 28基 于 SPR 技術測定了高遷移率族蛋白 l (HMGBl與肝素 及與晚期糖基化終產物受體 (RAGE的親和作用。 通 過實時分析親和常數(shù),探討了肝素對 HMG

19、Bl 與 RAGE 結合親和力的影響,為研究臨床藥效明顯而 作用機制不明確的藥物提供了新的思路。 王于杰等 29則制備了兩種 SARS 病毒抗原的檢測芯片,利用 SPR 生物傳感器進行了 SARS 病毒抗原檢測的研 究,結果發(fā)現(xiàn)這種芯片可以直接檢測到病毒培養(yǎng)液 上清中的滅活 SARS 病毒。該方法不但檢測靈敏度 高,而且可以利用參比位點檢測待測物中雜質引起 的非特異性吸附,使檢測結果更為可靠。利用 SPR 技術還可進行藥物結合位點的研究。 胰島素樣生長因子 -1受體 (IGF-1R信號轉導通路與 各種正常生理活動及多種疾病發(fā)生密切相關。李雪 玲等 30將 I G F -1R 來源的未磷酸化多肽

20、序列 LYASVNPEY 固定于 SPR 共振生物傳感器芯片表 面,以含有相應蛋白激酶的細胞裂解液進行處理, 研究證實了只存在磷酸化的多肽與其下游的胰島素 受體底物 (IRS-1相互作用。 SPR 技術也可用于手性 藥物對映體與生物分子間結合作用位點差異的研 究。鄒向宇等 31研究了手性藥物 D -苯甘氨酸、 L-苯甘氨酸與人血清白蛋白和鼠血清白蛋白的結合 作用, 發(fā)現(xiàn) L-苯甘氨酸與兩種白蛋白的結合力都大 于 D-苯甘氨酸的結合力。 Sandblad 等 32則對普萘洛 爾、華法林、美拉加群三種手性藥物與不同蛋白質 的相互作用進行了研究。根據(jù)結合力強弱分為三 組,并指出與藥物華法林存在中等結

21、合的人血清白 蛋白上存在有手性選擇性位點和無手性選擇性位 點,給出了三種解離平衡常數(shù)值,探討了寬的藥物 濃度范圍的重要性, 并研究了溶劑 DMSO 對手性藥 物與蛋白質相互作用的影響。 3 前景和展望SPR 生物傳感技術以其高靈敏度、高通量和免 標記等特點,已經成為藥物研究領域的一種重要的 工具 33。特別是 SPR 技術和其他方法的聯(lián)用,大 大拓寬和加快了該技術在藥物研究中的應用范圍和 研究周期。例如和質譜的聯(lián)用,可以利用 SPR 技 術先篩選出與靶標分子有強相互作用力的分析物, 然后結合質譜檢測分析物的化學結構,可大大加快 新藥的篩選速度 34。近來又發(fā)展出 SPR 與熒光、液 相 -質譜

22、 /質譜等相關技術的聯(lián)用系統(tǒng) 35,有理由相 信,隨著 SPR 技術的不斷發(fā)展與完善,結合各個 領域研究的深入, SPR 技術必將在今后的藥物研究 中有更廣泛的應用。參考文獻 1Hägele S, Kühn U, Böning M, et al. Cytoplasmic polyadenylation-element- binding protein (CPEB1 and 2 bind to the HIF-1 mRNA 3'-UTR and modulate HIF-1protein expression. Biochem J, 2009, 417(1:

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