結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程    采用一對PCR引物和一個熒光雙標(biāo)記的探針，該探針能與引物擴(kuò)增區(qū)域中間的一段DNA模板發(fā)生特異性結(jié)合，從而將PCR技術(shù)和熒光檢測技術(shù)結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)了對TB核酸的自動化檢測；檢測靈敏度為10個TB菌/毫升，反應(yīng)管在PCR循環(huán)結(jié)束后無需開蓋；采用了dUTP-UNG酶防污染     采用一對PCR引物和一個熒光雙標(biāo)記的探針，該探針能與引物擴(kuò)增區(qū)域中間的一段DNA模板發(fā)生特異性結(jié)合，從而將PCR技術(shù)和熒光檢測技術(shù)結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)了對TB核酸的自動化檢測；檢測靈敏度為10個TB

2、菌/毫升，反應(yīng)管在PCR循環(huán)結(jié)束后無需開蓋；采用了dUTP-UNG酶防污染系統(tǒng)。 可用于可疑結(jié)核病患者經(jīng)處理的痰液標(biāo)本結(jié)核分支桿菌核酸的定性檢測，可用于結(jié)核病的輔助診斷。    1、儲存條件及有效期 本試劑盒貯存于-20的條件下有效期為12個月（請于有效期內(nèi)使用） 2、自備試劑 4% NaOH、滅菌生理鹽水 3、樣本采集 3.1 以清晨第一口痰為宜。 3.2 先用清水漱口，囑患者用力咳出深部的痰于無菌樣本保存管，密封送檢。 4、樣本存放 4.1 待測樣本在2-8保存不應(yīng)超過24小時。 4.2 -20保存不超過三個月；。 4.3 -70以下長期保存。 4.

3、4 應(yīng)避免反復(fù)凍融。 5、樣本運(yùn)輸 采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進(jìn)行運(yùn)輸。 6、擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)） 6.1 從試劑盒中取出TB PCR反應(yīng)液、Taq酶及UNG，室溫融化并振蕩混勻后，2,000rpm離心10sec。 6.2 設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為n（n = 樣本數(shù) + 1管陰性對照 + 1管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系配制如下表： 6.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000儀器，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的毛細(xì)管 試 劑  TB PCR反應(yīng)液  Taq酶  UNG   用 量  17.8 ul &

4、#160;0.2 ul  0.03 ul   計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積離心管中，充分混合均勻，2000rpm離心10sec，向設(shè)定的n個Roche毛細(xì)管(LightCycler)中或普通PCR反應(yīng)管(Roter-Gene2000/3000)中分別加入18ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 6.22 PE Gene Amp 5700，PE Gene Amp 7700，ABI-7000，ABI-7300，BIO-RAD iCycler，Line-Gene，Line-Gene，MJ Opticon，MJ Opticon 等儀器，準(zhǔn)備好相應(yīng)的反應(yīng)管 試 劑  TB PC

5、R反應(yīng)液  Taq酶  UNG   用 量  378 ul  0.2 ul  0.06 ul   計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積離心管中，充分混合均勻，2000rpm離心10sec，向設(shè)定的n個PCR 反應(yīng)管中分別加入38ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。 7、樣本處理（樣本處理區(qū)） 7.1 首先對痰液樣本進(jìn)行目測，若樣本中唾液占絕大部分，則需重新采集樣本。 7.2 目測合格后，在樣本中加入23倍體積4的NaOH溶液。 7.3 37恒溫處理30min或常溫下1hr，使其充分液化，無明顯固狀物并且吸出時無拖絲現(xiàn)象即為液化完全。 7

6、.4 若液化不完全，可適當(dāng)再加入少量4的NaOH溶液直至液化完全。 7.5 取液化后的標(biāo)本900ul以及試劑盒中的陰性對照、陽性對照各500ul于1.5ml無菌離心管中，13,000rpm離心10min。 7.6 棄上清（先倒出大部分液體，再用移液器盡量吸干至無明顯液滴為止）。 7.7 沉淀中加入1ml滅菌生理鹽水，振蕩懸?。ㄗ⒁猓喊淳o離心管蓋后，橫向按在漩渦振蕩器上將沉淀振起）。 7.8 13,000rpm離心10min。 7.9 棄上清，用1ml滅菌生理鹽水洗滌沉淀。 7.10 13,000rpm離心10min。 7.11 棄上清，向沉淀中加入DNA提取液30ul，振蕩混勻。 7.12 2

7、,000rpm離心5sec，放37溫浴30min。 7.13 再放入100水浴/干浴10min。 7.14 13,000rpm離心10min，保留上清備用。 7.15 如果樣本裂解產(chǎn)物當(dāng)天不使用，請于-20保存。 8、加樣（樣本處理區(qū)） 8.1 若樣本及對照品裂解產(chǎn)物保存在-20，使用前置室溫解凍，以13,000rpm離心5min。 8.2 Roche儀器 8.21在所設(shè)定的n個Roche毛細(xì)管中分別加入步驟7中處理過的樣本、陰性對照、陽性對照上清液各2ul。 8.23 蓋緊管蓋，連同Roche專用金屬反應(yīng)管套放在離心機(jī)中，于2,000rpm離心10sec。 8.24 將毛細(xì)管排好放入Roch

8、e PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。 8.3 非Roche儀器 8.31 向所設(shè)定的n個PCR反應(yīng)管中分別加入步驟6中處理過的樣本、陰性對照、陽性對照上清液各2ul。 8.32 蓋緊管蓋，將PCR 反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)，置于PCR儀上，記錄樣本擺放順序。 9、PCR擴(kuò)增（檢測區(qū)） 9.1 循環(huán)擴(kuò)增條件 9.1.1 Roche Lightcycler a) 37：3 min； 93：1 min； b) 93：5 sec, 60：40 sec（Acquisition Mode為Single）40個循環(huán)，Analysis Mode為Quantification。 9.1.2 Roter-Gene2000

9、/3000 a) 37：5 min； 94：1 min； b) 95：5 sec, 60：30 sec，40個循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為20ul。熒光信號收集設(shè)在60。 9.1.3 PE Gene Amp5700，7700，ABI-7000，7300， a) 37：5 min； 94：1 min； b) 95：5 sec, 60：30 sec，40個循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為40ul。 9.1.4 Line-Gene, a) 37：5 min； 94：1 min； b) 95：5 sec, 60：40 sec，40個循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為40ul。 9.1.5 BIO-RAD iCycler a) 37：5 mi

10、n； 94：1 min； b) 95：5 sec, 60：30 sec，42個循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為40ul。 9.1.6 MJ Opticon, a) 37：5 min； 94：1 min； b) 95：5 sec, 60：30 sec，40個循環(huán)。反應(yīng)體系設(shè)為40ul。熒光信號收集設(shè)在60。 9.2 儀器檢測通道選擇 9.21 Roche Lightcycler 選擇F1通道。 9.22 Roter-Gene2000/3000 Acquisiton選擇Fam。 9.23 PE Gene Amp 5700，7700，ABI-7000，7300 a) PE Gene Amp 5700是單通道熒光P

11、CR檢測儀，無需選擇檢測通道。 b) PE Gene Amp 7700, ABI-7000，7300 Reporter設(shè)為FAM，Quencher設(shè)為TAMRA。Passive Reference設(shè)為None（ABI-7000，7300）。 9.24 BIO-RAD iCycler 熒光素選擇FAM-490。 9.25 Line-Gene, 選擇F1通道，增益值批間有所不同，應(yīng)按每批試劑建議值設(shè)定。（每一批試劑的增益值詳見試劑盒中給定值） 9.26 MJ Opticon, a) Opticon是單通道熒光PCR檢測儀，無需選擇熒光通道。 b) Opticon 是雙通道熒光檢測儀，由于實(shí)驗(yàn)只需要

12、單熒光，選擇Single Color Experiment。 10、結(jié)果分析條件設(shè)定 10.1 Roche Lightcycler 10.11 選擇F1或F1F2通道（建議選擇F1通道），點(diǎn)擊Quantification進(jìn)入定量分析窗口。 10.12 在Quantification窗口中，設(shè)定Analysis 方式為Fit points，Adjustment 方式為 proportional。 10.13 選定Noise band項(xiàng), 閾值（Noise band cursor）設(shè)定以剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準(zhǔn)。 10.14 也可根據(jù)儀器

13、的實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。 10.2 Roter-Gene2000/3000 閾值(Threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值無數(shù)值為準(zhǔn)。 10.3 PE Gene Amp 5700，7700，ABI-7000，7300 10.31 PE Gene Amp 5700 結(jié)果分析時基線（baseline）的確定：取610或615個循環(huán)的熒光信號。閾值(threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值=40.0為準(zhǔn)。 10.32 PE Gene Amp 7700，ABI-7000，7300結(jié)果

14、分析時基線（baseline）的確定：取310或315個循環(huán)的熒光信號。閾值(threshold)設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值=40.0為準(zhǔn)。 10.4 BIO-RAD iCycler 10.41 果分析時基線（baseline）的確定，基線（baseline）取為210或215個循環(huán)的熒光信號。 10.42 閾值(threshold) 設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值=0.0為準(zhǔn)。也可根據(jù)儀器噪音情況在15.040.0之間調(diào)整。 10.5 Line-Gene, 10.51擊數(shù)據(jù)分析進(jìn)入結(jié)果分析

15、界面。 10.52選擇樣點(diǎn)擬合法進(jìn)行結(jié)果分析：零點(diǎn)調(diào)整取110或115個循環(huán)的熒光信號。 10.53在噪聲容限界面下調(diào)整基線位置，其設(shè)定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴(kuò)增線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。 10.54選擇定量分析，對樣本進(jìn)行結(jié)果分析。 10.6 MJ Opticon, 10.61擊Quantitation進(jìn)入結(jié)果分析窗口 10.62在Option選項(xiàng)區(qū)域進(jìn)行基線以及閾值線的調(diào)整。 10.63取為210或215個循環(huán)的熒光信號，閾值(threshold) 設(shè)定原則以閾值線剛好超過陰性對照品擴(kuò)增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點(diǎn)，且Ct值顯示為none為準(zhǔn)。 10.64也可根據(jù)儀器

16、噪音情況在15.040.0之間調(diào)整。 10.65在用PE5700/7700,ABI-7000,7300/BIO-RAD, Opticon,/ Line-Gene, iCycler熒光定量PCR檢測儀進(jìn)行分析的過程中，為避免漏檢強(qiáng)陽性樣本， a) 應(yīng)首先將基線定為610/310/210/110個循環(huán)的熒光信號觀察分析Ct值。 b) 如果沒有Ct值16.0的樣本，則將基線改定為615/315/215個循環(huán)的熒光信號進(jìn)行結(jié)果分析。 c) 如有Ct值16.0的樣本，則應(yīng)將該樣本剔除此次結(jié)果分析。 d) 同時仍將基線改定為615/315/215個循環(huán)的熒光信號進(jìn)行結(jié)果分析。 11、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 11.1 陰

17、性對照的Ct值均應(yīng)等于40.0(PE5700和7700)或無數(shù)值。 11.2 陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于30.0。 11.3 否則，此次實(shí)驗(yàn)視為無效。 12、結(jié)果判斷 12.1 Ct值等于40或0的樣本為陰性樣本。 12.2 檢測樣本Ct值37.0者判為陽性。 12.3 Ct值大于37.0的樣本建議重做。 12.4 重做結(jié)果Ct值40者為陽性，否則為陰性。 13、試劑盒使用注意事項(xiàng) 13.1 有關(guān)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范請嚴(yán)格按照行業(yè)行政主管部門頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管 理規(guī)范執(zhí)行。 13.2 本試劑盒僅用于體外檢測。 13.3 陽性工作標(biāo)準(zhǔn)品具體拷貝數(shù)請參照試劑盒內(nèi)給定值。 13.4 實(shí)驗(yàn)請嚴(yán)格分區(qū)操作： 13.41 第一區(qū)：PCR前準(zhǔn)備區(qū) 準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑； 13.42 第二區(qū)：樣本處理區(qū) 待測樣本和對照品處理； 13.43 第三區(qū)：檢測區(qū) PCR擴(kuò)增檢測。 13.5 各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，避免污染，實(shí)驗(yàn)后即請清潔工作臺。 13.6 試劑盒內(nèi)各試劑使用前，充分融化并振蕩混勻后請稍事離心。 13.7 在20保存的樣本裂解產(chǎn)物，應(yīng)在加樣前置室溫