跨界正流行以定量pcr 來分析蛋白

1、 定量 PCR 能分析蛋白嗎?你肯定會說,開玩笑。不過這是千真萬確的,一向以創(chuàng)新著稱的美國應 用生物系統(tǒng)公司剛剛推出了 TaqMan® Protein Expression Assays,首次應用 TaqMan® 分析與實時定 量 PCR 來定量蛋白表達,能對有限數(shù)量的人胚胎干細胞培養(yǎng)物中的多能標志物進行快速輕松的鑒定及 相對定量。細胞的鑒定是一個新興的領域, 直到現(xiàn)在,TaqMan® 5這個試劑盒究竟是如何定量的。 其實它是基于一項新穎的檢測方法,稱為 PLA - Proximity Ligation Assay技術。 PLA 利用親和 系統(tǒng)來定量檢測蛋白的 存

2、在,適用于含 10-500(就 是帶了一段 oligo 尾巴的抗體共同孵育。每個蛋 白設計有兩個探針 A 和 B 。之后用 DNA 連接酶將 兩段 oligo 連接起來, 如圖 1所示。 經(jīng)過酶的滅活, 就能夠進行實時定量 PCR 了。沒有洗 滌步驟,所需的細胞量比 western blot方法低 100-500倍。與傳統(tǒng)的 基因表達分析一 樣, TaqMan® 蛋白表達分析所得的數(shù)據(jù)很容易進 行相驟, 能釋放所有類型的蛋白, 此 步驟與 TaqMan®試劑結合,創(chuàng)造出高度靈敏而特 異的過程, 來測定少量樣品中的蛋白表達。 整個實 驗過人胚胎干研究人員還需要使用頗費勞力的蛋

3、白分析技 術, 如流式細胞術、 免疫染色及 western blot分析。 這些方法不夠靈敏,本身也很難定量。 TaqMan® 蛋白表達分析則采用一步法裂解樣品及簡化的實 時定量 PCR 流程, 3.5小時就能從樣品中獲得數(shù) 據(jù),而所需樣品量只有其他方法的 1/100-1/10。TaqMan® 蛋 白 表 達 分 析 利 用 金 標 準 的 核酸酶試劑來定量蛋白表達, 其工作 流程和樣品量與普通的 mRNA 及 microRNA 分析 相似。由于蛋白表達結果是來自相同的分析平臺, 那么這些創(chuàng)新的分析能夠將 mRNA 和 /或 miRNA 的表達與蛋白表達直接關聯(lián)。 其它任一

4、種蛋白定量 分析方法都不具備這個能力。新穎的原理你一定很納悶純 化的抗體和實時定量 PCR個細胞的裂解液。首先將細胞裂解,然后與抗體 -oligo-探針這些預先設計的分析非常簡單且可靠, TaqMan®對定量, 且極其適合多能和分化干細胞中的標 志物相對定量。簡化的流程TaqMan® 蛋白表達分析流程運用了簡單的 一步法樣品裂解步程, 從樣品到數(shù)據(jù), 在 3.5小時內(nèi)就能完成 (圖 2,操作時間僅為 1.5小時。所有試劑都已為分 析細胞培養(yǎng)物中的蛋白而優(yōu)化。樣品制備過程溫 和, 一步法細胞裂解用的是非離子型去污劑。 隨后 樣品能與任何蛋白表達分析試劑盒的分析探針混 合,而分

5、析探針的結合需要 60分鐘。然后加入連 接酶將寡核苷酸連接起來,接著是 15分鐘的滅活 或純化步驟, 來消化所有蛋白。 再通過單次的板轉 第 12 頁,共 22 頁 下一頁 返回 移將試劑轉移到 PCR 平板上,進行快速實時定量 PCR 。圖 2. TaqMan®蛋白表達分析的詳細流程。每反應分而開發(fā),包括 hICAM1、 hCSTB 、 hOCT3/4、 hNANOG 、 hSOX2和 hLIN28,再加 上支持試劑來監(jiān)測人胚胎干細胞的相對蛋白水平。 TaqPCR能 夠 在 Applied Bios 速實時定量 系統(tǒng)上進 小時內(nèi)得到實時定量的實時定量讓實時 定量 比以往更容易開展。

6、 有了新一代軟件, 這 些 系 統(tǒng) 簡 單 , 當 然 , 它 們 還 有 著無人可比的性能、 質量以及長期可靠性 關于我們快速實時定量 系統(tǒng) 的 完 整 產(chǎn) 品 信 息 , 請 登 陸個反應孔只需要 2 uL起始樣品(10-500個細胞 /uL。對于 TaqMan®分析的步驟 4, 10 uL連接 樣品再加上混合液, 構成了 20 uL的實時定量 PCR 終體積。便利易用的 析預先設計的 TaqMan® 蛋白表達分析是專為 一些人蛋白靶點Man® 蛋白表達分析產(chǎn)品線還包括核心試劑 盒、 陽性與陰性對照樣品細胞裂解液試劑盒, 以及 免費的數(shù)據(jù)分析軟件。 核心試劑盒

7、中包含分析運行 所需的所有試劑,包括連接體寡核苷酸、連接酶、 通用的 TaqMan®分析、 新的 TaqMan® 蛋白表達 快速混合液, 需要與每個蛋白表達分析試劑盒一起 運行分析?？煽康膶崟r定量 平臺TaqMan® 蛋 白 表 達 分 析ystems 的任一臺快 PCR行,并在一 PCR 的結果。 Applied BiosystemsPCR 系統(tǒng)提供了 強大的解決方案來滿足任何實驗室的需求, PCR使 用 Applied Biosystems的記錄作為支持。 PCR 。s 實時定量 PCR 系統(tǒng) 所提供的精密軟件包有助于實驗設定、分析性能測試。 免費的 TaqMan® 蛋白表達分析數(shù) 據(jù)分析軟件工具可在直觀的數(shù)據(jù)分析軟件所有 Applied Biosystem數(shù)據(jù)收集和 下過 分 析 設 計 的 創(chuàng) 新 改 變 , Applied Biosystems品, 盡在 2009十大創(chuàng)新產(chǎn)品評選, 歡 載。通將 TaqMan&#