內(nèi)容詳細(xì) 可溶性hPPARγ-LBD重組蛋白的制備及功能表征

1、指導(dǎo)教師姓名(職稱、單位名稱余瑜教授/博導(dǎo)申請學(xué)位級別 碩 士 學(xué)科、專業(yè)名稱藥物化學(xué)諮寸旌鞋鉭日 2010年5月論文答辯年月 ±!一 2010年5月重慶醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)位論文獨創(chuàng)性聲明 lIllll l I I I I I I I I I I l I Y1730659本人申明所呈交的論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研 究成果。據(jù)我所知,除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外,論文中不包含其他 人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果,也不包含為獲得重慶醫(yī)科大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu) 的學(xué)位或證書而使用過的材料,與我同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已 在論文中作了明確的說明并表示謝意。申

2、請學(xué)位論文與資料若有不實之處,本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任.學(xué)位論文作者簽名:上塾墜日期:j笙蘭嘩學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書;本人完全了解重慶醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保護(hù)知識產(chǎn)權(quán)的規(guī)定,即:研究生在攻讀學(xué) 位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬重慶醫(yī)科大學(xué).本人保證畢業(yè)離校后,發(fā)表論 文或使用論文工作成果時署名單位為重慶醫(yī)科大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān) 部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤,允許論文被查閱和借閱.學(xué)?？梢怨紝W(xué) 位論文的全部或部分內(nèi)容(保密內(nèi)容除外,可以采用影印,縮印或其他手段保 存論文.論文作者簽名:指導(dǎo)教師簽名:日 期:目 錄符號說明.1中文摘要.4英文摘要6論文正文:可溶性hPPAR丫.LBD重組蛋白的制

3、備及功能表征9前言。9第一部分可溶性hPPAR丫.LBD重組蛋白的表達(dá)ll 1實驗材料.1l 2方法和結(jié)果.16 3討論2l 4,J、結(jié).22第二部分hPPART.LBD重組蛋白的純化。23 1實驗材料。23 2方法和結(jié)果.24 3討論29 4,j、結(jié)29第三部分hPPART.LBD重組蛋白的體外生物學(xué)活性研究。30 1實驗材料3l 2方法和結(jié)果32 3討論.46 4,J、結(jié).47全文總結(jié)。48參考文獻(xiàn).49文獻(xiàn)綜述.52至定謝.。.。.56攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文.57mL mL/min mm mmol/L mol/L ngnm nmol/L rpm Ss/d lag lag/mL 山 岬

4、 lamol/L V W 體積流速長度物質(zhì)的量濃度物質(zhì)的量濃度質(zhì)量長度物質(zhì)的量濃度轉(zhuǎn)速時間流速質(zhì)量濃度體積長度物質(zhì)的量濃度電壓強(qiáng)度功率毫升毫升每分鐘 毫米毫摩爾每升 摩爾每升 納克納米納摩爾每升 轉(zhuǎn)每分鐘 秒秒每滴 微克微克每毫升 微升 微米 微摩爾每升 伏特 瓦特重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文英文縮寫 AAMPAPAUCBis13-MebpBSAcDNADBDDMSODNADTTE.coliEDTAGSTHEPESHis6船LC hPPARy-LBD IPTGkbLBLBDLOD 英文全稱AbsorbanceAmpicillinAmmonium persulphateArea under t

5、he curveN.N'-Methylene BisacrylamideBeta-mercaptoethanolBase pairBovine serum albuminComplementary deoxyribonucleic acidDNA binding domainDimethyl sulfoxideDeoxyribonucleic acidDL.dithiothreitoiEscherichia coliEthylene diamine tetraacetic acidGlutathione S.transferaseHydroxyethl piperazine ethan

6、esulfonicacidHistidineHigh Performance LiquidChromatographyHuman peroxisomeproliferators-activated receptor 1,ligandbinding domainIsopropyl-13-D-ThiogalactopyranosideKilo base pairLuria.Bertani brothLigand binding domainLimit of detection2中文吸光度氨芐青霉素過硫酸銨曲線下面積甲叉雙丙烯酰胺D.巰基乙醇堿基對牛血清白蛋白互補(bǔ)脫氧核糖核酸 DNA結(jié)合域二甲基亞砜

7、脫氧核糖核酸二硫蘇糖醇大腸桿菌乙二胺四乙酸谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶 羥乙基哌嗪乙磺酸六聚組氨酸高效液相色譜法千堿基對LB培養(yǎng)基配體結(jié)合域檢出限MBPNBODPBS.PPAR值 PPAR3 PPARy PPRESRosRRBARSDRXRSBSDSDS SDS.PAGESEC SEC.HPLCS/NTBTEMED 確S TZDUV重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文Maltose binding proteinNonspecific bindingOptical densityPhosphatic buffer solution麥芽糖連接蛋白非特異性結(jié)合光密度磷酸緩沖液Peroxisome prolifer

8、ators.activated 過氧化物酶體增殖物激 receptor旺活受體0【Peroxisome proliferatorsactivated 過氧化物酶體增殖物激 receptor B 活受體13Peroxisome prol iferatorsactivated 過氧化物酶體增殖物激 receptor丫 活受體7Peroxisome proliferators response 過氧化物酶體增殖物相 elementsRosiglitazone應(yīng)元件羅格列酮Radio.1igand receptor binding assay 放射配體受體結(jié)合實驗 Relative standard

9、deviationRetinoid X-receptor相對標(biāo)準(zhǔn)偏差視黃酸X受體Specific binding 特異性結(jié)合Standard deviation 標(biāo)準(zhǔn)偏差Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸鈉Sodium dodecyl sulfate.polyacrylamide SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 gel electrophoresis泳Size-exculsion chromatography 分子排阻色譜Size-exculsion chromatography.High 分子排阻色譜.高效液 performance liquid chromatograph

10、y 相色譜法Signal noise ratioTotal bindingTerrific broth信噪比總結(jié)合四甲基乙二胺 Tris(hydroxymethyl一aminomethane 三羥甲基氨基甲烷 Thiazolidinedione 噻唑烷二酮類Ultra violet spectroscopy3紫外光譜重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文可溶性hPPAR7.LBD重組蛋白的制備及功能表征 摘要癌癥是人類最難攻克的頑癥之一。目前臨床上的抗腫瘤藥物均存 在毒性大、選擇性差等問題,為此,開發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物具有 十分重要的意義。近年來,國內(nèi)外針對抗腫瘤藥物的研究正從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性抗腫 瘤

11、藥物轉(zhuǎn)向針對腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中多環(huán)節(jié)作用靶點的抗腫瘤藥物, 其中的熱點之一就是以脂代謝信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶點蛋白PPAR丫亞 型(peroxisome proliferater-activated receptor Y,PPA腳作為藥物靶點的 抗腫瘤藥物研究,此類藥物研究的難點在于獲取大量高純度、具有生 物學(xué)功能的靶點重組蛋白。為此,本文采用六聚組氨酸(His6為標(biāo)簽, 構(gòu)建了pReceiver-B01一hPP觸q-LBD表達(dá)載體,通過表達(dá)純化得到可溶 性的hPPAIqLBD(human peroxisome proliferater-activated receptor丫 ligand bi

12、nding domain,hPPA腳-LBD重組蛋白,有利于進(jìn)一步研究其結(jié) 構(gòu)和功能;并采用分子排阻色譜.高效液相色譜法(size exculsion chromatographyhigh performance liquid chromatography,SEC-HPLC對 hPPAR7.LBD重組蛋白與配體藥物的結(jié)合活性進(jìn)行了研究,為以 hPPARy.LBD重組蛋白為靶點蛋白的藥物設(shè)計及篩選奠定了基礎(chǔ)。 本文完成的主要工作和結(jié)論如下:.1.制備了hPPARy-LBD重組蛋白。經(jīng)SDS.PAGE分析,該重組蛋 4重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文白的分子量約為32kDa,與理論分子量致。2.優(yōu)化

13、了hPPARl,-LBD重組蛋白的表達(dá)條件。在優(yōu)化條件(16, 0.6mmol/L IPTG,誘導(dǎo)20h下,能表達(dá)可溶性的llP吶.LBD重組蛋 白。3.優(yōu)化了hPPARl,-LBD重組蛋白的純化條件。經(jīng)鎳親和色譜純化 后,以每升LB培養(yǎng)基計可獲得41mg、純度為95%的hPPA腳.LBD重 組蛋白。4.建立了分子排阻色譜一高效液相色譜法(SEC.HPLC,考察了 hPPAR7一LBD重組蛋白與配體藥物結(jié)合的活性。該重組蛋白能與羅格 列酮特異性結(jié)合,其結(jié)合率達(dá)到65%。綜上所述,本文成功制備了具有生物學(xué)活性的可溶性hPPARl,-LBD 重組蛋白,基于脂代謝靶點蛋白hPPARV.LBD建立了快

14、速、穩(wěn)定及準(zhǔn) 確性高的抗腫瘤藥物體外篩選模型方法,為抗腫瘤新藥的設(shè)計和篩選 奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:靶點蛋白,hPPAR,-LBD,重組蛋白,表達(dá),分子排阻色 譜.高效液相色譜法PREPARATIoN AND FUNCTIONALCHARACTERlZATION OF SOLUBLE HUMANPPARyLBDRECOMBINANT PROTEINA BSTRACTCancer is one of the most difficult of the obstinate illness for human to overcome.There are many kinds of anticancer

15、drugs for clinical therapy, which are still to be faced with problems of toxicity and poor selectivity. Therefore,the development of highlyefficient and low toxicity anticancer drugs is very important.In recent years,at home and abroad the study of anticancer drug is turning from traditional cytotox

16、icanticancer drugs to the anticancer drugs which are for multi.1ink targets of tumor signal transduction pathways.One of the hot spots is the study of PPARy subtypes(peroxisome proliferater-activated receptor丫,PPART,which isthe key protein in the signal transduction of lipid metabolism.In order to s

17、tudy on the hPPARy.LBD(human peroxisome proliferater-activated receptor丫Ligand binding domain,hPPARyLBDrecombinant proteins.Now,it is very difficult to obtain abundant high purity recombinant protein with the biological function.Therefore,we constructed pReceiver-B01_hPPAR丫。 LBD expression vector wi

18、th the tag his6in the paper,prepared the soluble 6hPPARy.LBD recombinant protein through expressionand purification, determined the binding activity of the hPPAR7一LBD recombinant protein and its ligand drugs with the size exclusion chromatographyhigh performance liquid chromatography(SEC-HPLCin orde

19、r to advance the drug design and screening based on lipid metabolism target proteins hPPAR7-LBD.The main work done and conclusion definited in the topic included these parts as below:1.The hPPAR7.LBD recombinant protein was prepared.Its molecular weight is about 32kDa bySDS-PAGE analysis,which is co

20、nsistent with the theoretical molecular weight calculated by amino acid sequence.2.The expression conditions of hPPAR丫一LBD recombinant protein was optimizated.Under optimal conditions of 16,0.6mmol/L IPTG andinduction time 20h,the soluble recombinant protein was expressed successfully.3.The purifica

21、tion conditions of hPPAR7一LBDrecombinant protein was optimizated.hPPAR7一LBD recombinant protein with weight of 41mg, purity of 95%could obtain in the LB medium perliter after purified by nickel-affinity chromatography.4.The SEC.HPLC was establishied.The binding activity of hPPAR7.LBD recombinant pro

22、tein with ligand drugs in vitro was inspected.The recombinant PPAR7.LBD could bind specifically with rosiglitazone with binding rate of 65%.In summary,we prepared hPPARl,一LBD recombinant protein with biological fimction in the paper.And it may lay thefoundation for studying on hPPAR7.LBD target,desi

23、gning or screening new anticancer drugs.Keywords:target protein,hPPA腳-LBD,recombinant protein, expression,SEC-HPLC8重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文可溶性hPPAR7.LBD重組蛋白的制備及功能表征 .上.J刖 舌癌癥是對人類危害最大的疾病之一,目前癌癥已位居我國居民死因之首。雖 然已有許多抗腫瘤藥物用于臨床,且取得了一定的療效,但仍存在毒性大、選擇 性差等問題,為此,開發(fā)新作用機(jī)制或新結(jié)構(gòu)類型的高效低毒抗腫瘤藥物具有重 要的現(xiàn)實意義。近年來,國內(nèi)外針對抗腫瘤藥物的研究正從傳統(tǒng)的細(xì)胞

24、毒性抗腫 瘤藥物轉(zhuǎn)向針對腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中多環(huán)節(jié)作用靶點的抗腫瘤藥物,其中以脂代 謝信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵靶點蛋白PPA聊亞型作為藥物靶點進(jìn)行抗腫瘤藥物的研究 就是其中的熱點之一。PPARY是一種II型核激素受體ill,具有豐富的生物學(xué)功能,是目前研究最多 的核激素受體之一。hPPAR7基因位于第3號染色體上,包括四個功能區(qū)圳2】?A/B、 C、D和E/F。其中,A/B為非配體依賴的活化域;C為DNA結(jié)合區(qū):D為鉸鏈區(qū); E/F為配體結(jié)合區(qū)(iigand-binding domain,LBD。在體內(nèi),藥物靶點蛋白PPARy是由PPAR7亞型與視黃醇類X受體(retinoid X receptor,

25、RXR形成異二聚體,允許PPAR丫亞型的配體結(jié)合區(qū)域(PPARy.LBD與兩 種蛋白相互接觸而產(chǎn)生作用,再與所調(diào)節(jié)基因啟動子上游的一段特定DNA序列即 PPAR丫反應(yīng)元件(peroxisome proliferators response elements,PPREs結(jié)合,調(diào)控下游 靶基因的轉(zhuǎn)錄活化,從而發(fā)揮一系列生物活性【3l,這也正是藥物靶點蛋白研究的熱 點。PPAR7亞型主要分布在脂肪組織,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞脂代謝和糖代謝【41,脂肪細(xì)胞 分化瞪l,增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性61,抑制炎癥反應(yīng)71,抗動脈粥樣硬化【81等, 但是近年來有文獻(xiàn)報道PPAR7在多種腫瘤組織中高表達(dá),其配體能通過PPA

26、R丫依 賴或非依賴方式抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡,表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用19431, 使其極有希望成為抗腫瘤藥物的作用靶點。在體外,基于hPPA腳.LBD作為藥物作用靶點建立配體藥物篩選模型,可以 進(jìn)行抗腫瘤藥物的設(shè)計與篩選研究。在篩選模型建立中,最關(guān)鍵的是在于如何獲 取大量高純度、具有生物學(xué)功能的hPPA腳.LBD重組蛋白。早期采用天然提取方9重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文式得到具有良好生物學(xué)功能的蛋白量很小,滿足不了研究所需的用量。但隨著基 因重組技術(shù)的發(fā)展,大量重組蛋白在各種細(xì)菌中被成功表達(dá),加之各種融合表達(dá) 親和標(biāo)簽的應(yīng)用,不僅改善了融合表達(dá)重組蛋白的溶解性,而且簡化了純化過程, 這

27、對于獲取大量高純度、具有生物學(xué)功能的hPPA腳.LBD重組蛋白得以實現(xiàn)。目 前常用的主要融合表達(dá)親和標(biāo)簽有;谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST1141、麥芽糖結(jié)合蛋白(malt0Se binding protein,MBP151和六個組氨酸(His6等 B61,其中GST和MBP標(biāo)簽雖能提高融合產(chǎn)物的溶解性,但由于其分子體積大, 易干擾蛋白質(zhì)的功能,進(jìn)行功能分析時必須先切掉標(biāo)簽,這有可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)失 活:而His6標(biāo)簽因其分子體積小、對蛋白活性影響較小、無免疫源性、親和純化 方便等優(yōu)勢被廣泛用于重組蛋白的融合表達(dá)。因此,本文采用His6為標(biāo)簽,構(gòu)建p

28、Receiver-B01-hPPARr.LBD原核表達(dá)載體, 利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),通過表達(dá)純化制各可溶性的hPPARl,.LBD重組蛋白;并 采用分子排阻色譜一高效液相色譜法(SEC.HPLC,測定hPPARr。LBD重組蛋白與配 體藥物的結(jié)合活性,評價其功能活性。本文為制備大量高純度、具有生物學(xué)功能 的可溶性hPPARVLBD重組蛋白及功能表征,擬開展以下三部分研究工作:第一部分可溶性hPPARr.LBD重組蛋白的表達(dá)第二部分11PPARV.LBD重組蛋白的純化第三部分hPPARV.LBD重組蛋白的體外生物學(xué)活性研究10r重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第一部分 可溶性hPPAR7.LBD重

29、組蛋白的表達(dá)1實驗材料1.1質(zhì)粒和菌株(1菌株:感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21(DE3和E.coli DH5ct均購自北京TianGen 公司。(2質(zhì)粒:pReceiverB01質(zhì)粒購自廣州復(fù)能基因有限公司;1.2主要試劑及配制蛋白質(zhì)Marker(分子量大小依次為:94.0、66.2、 45.0、35.0、26.0、20.0、14.4kDa酵母膏(批號:970073.02蛋白胨(批號:612275氨芐青霉素(批號:20070914瓊脂(批號:200710911異丙基13D硫代半乳糖苷(分裝Plasmid Mini kit I(批號:00D69430l 0000125H028 北京TianGe

30、nOXOID,England OXOID,EnglandSigmaLvshengyuan Biotchnoigoy Merck公司OMEGA公司重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文三羥甲基氨基甲烷(批號:1346281 NOVON乙二胺四乙酸鈉(批號:20071112 AmrescoTriton X.100(分裝,純度>99% Merck公司溶菌酶(批號:20071l 14 Sigma低熔點瓊脂糖(批號:101710Lvshengyuan Biotchnolgoy 丙烯酰胺(批號:158294 NOVON甲叉雙丙烯酰胺(批號:20071102 NOVON十二烷基硫酸鈉(批號:20071ll 2

31、 Japan過硫酸銨(批號:20070916 Sigma四甲基乙二胺(批號:20071112 Amresco甘氨酸(批號:l 259344 NOVON溴酚藍(lán)(批號:20070915 Sigma考馬斯亮藍(lán)R.250(批號:20071109 SigmaD一巰基乙醇(批號:20071111 Sigma甘油(批號:2007ll 12 Sigma分別稱取酵母提取物(yeast extract5g,胰蛋白胨(tryptone10g,NaCI 10g, 用800mL超純水溶解后,緩慢滴加,1mL濃度為l mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至 7.O,再加入適量超純水,配制成1000mL的LB液體培養(yǎng)基,并于1

32、21高壓蒸 汽滅菌20min。分別稱取酵母膏5g,胰蛋白胨10g,NaCI 10g,瓊脂15g,用900mL超純 12lL重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文水溶解后,緩慢滴加l mL濃度為1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0,再加入適 量超純水,配制成1000mL的LB固體培養(yǎng)基,并于121下高壓蒸汽滅菌20rain。 在無菌操作臺中鋪制LB平板(約20mL培養(yǎng)基/板。稱取IPTG 4.76g,用100mL超純水溶解,0.22“m微孔濾膜過濾,分裝后儲 存于.20冰箱。30%丙烯酰胺溶液稱取三羥甲基氨基己烷(Tris90.75g,用400mL超純水溶解后,緩慢滴加濃 度為l mol/L的鹽酸

33、調(diào)節(jié)pH至8.8,再加入適量超純水,配制成500mL的分離膠 緩沖液,4下保存。濃縮膠緩沖液(1.0mol/L Tris,pH 6.8稱取Tris 60.55g,用400mL超純水溶解后,緩慢滴加濃度為1moVE的鹽酸 調(diào)節(jié)pH至6.8,再加入適量超純水,配制成500mL的分離膠緩沖液,4下保存。 10%十二烷基硫酸鈉(SDS稱取SDS 1.0g,用10mL超純水溶解后,配制成濃度為10%的SDS溶液,4 13重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文下保存。10%過硫酸銨(AP稱取AP 1.0g,用10mL超純水溶解后,配制成濃度為10%的AP溶液,4 下保存。5xTris.甘氨酸電泳緩沖溶液分別稱取T

34、ris l 5.1g,甘氨酸(glycine94g,SDS 5.0g,用800mL超純水溶解 后,再加入適量超純水,配制成1000mL的5xTris.甘氨酸電泳緩沖溶液,室溫下 保存。I xTris一甘氨酸電泳緩沖溶液由5xTris.甘氨酸電泳緩沖溶液稀釋即得。5×蛋白電泳上樣緩沖溶液l×蛋白電泳上樣緩沖溶液由5×蛋白電泳上樣緩沖溶液稀釋即得。固定液分別量取乙醇500mL,冰醋酸100mL,加入適量超純水混勻,配制成1000mL 的固定液,室溫下保存。0考馬斯亮藍(lán)R-250染液稱取考馬斯亮藍(lán)R-2502.5g,分別量取甲醇450mL,冰醋酸100mL,加入適 量超

35、純水混勻后,配制成1000mL的考馬斯亮藍(lán)R.250染液,1.2岬濾紙過濾, 室溫下保存。0脫色液分別量取乙醇50mL,冰醋酸100mL,加入適量超純水混勻后,配制成1000 mL的脫色液,室溫下保存。洗滌緩沖液(prI 7.5分別稱取Tris和NaCI適量,并調(diào)節(jié)溶液的pH值,配制成Tris濃度為10 14重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文mmol/L,NaCI濃度為150mmol/L,pH值為7.5的洗滌緩沖液。裂解緩沖液(pH 8.0分別稱取Tris、EDTA、NaCI、Triton X.100和溶菌酶適量,并調(diào)節(jié)溶液的pH 值,配制成Tris濃度為10mmol/L,EDTA濃度為l mmo

36、l/L,NaCI濃度為150 mmol/L,Triton Xloo濃度為0.5%,溶菌酶濃度為l mg/mL,pH值為8.0的裂解 緩沖液。1.3儀器設(shè)備LDZ.30KBS滅菌鍋YJ.1450型超凈工作臺RH.Q恒溫振蕩儀JYD.150智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) H.1750R高速冷凍離心機(jī)DYY-2C垂直板電泳槽DYY-2C蛋白質(zhì)電泳儀TS.1電泳振蕩儀UV-2102PCS紫外可見光光度計 實驗室專用超純水器微量可調(diào)移液器85.2恒溫磁力攪拌器電子分析天平(十萬分之一 BCD.220NIS電冰箱KQ5200DA型數(shù)控超聲清洗器 LGIOOB干燥箱15 上海申安醫(yī)療器械廠 蘇州凈化設(shè)備廠江蘇恒豐儀

37、器制造有限公司 上海之信儀器有限公司 湖南湘儀公司北京六一儀器廠北京六一儀器廠北京六一儀器廠尤尼柯Unico上海儀器公司 重慶利迪儀器公司德國Brand公司上海青浦瀘西儀器廠 瑞士梅特勒一托利多三星公司昆山市超聲儀器有限公司 上海儀器廠有限公司III重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文2方法和結(jié)果2.1融合表達(dá)載體的構(gòu)建及其DNA序列分析表達(dá)載體名稱為:pReceiver-B01-hPPA腳.LBD,其結(jié)構(gòu)如圖11所示。Vector Features圖1-1融合表達(dá)栽體的構(gòu)建示意圖Fig.11Profile of construction of recombinant expression vect

38、or由圖1.1可見,該表達(dá)載體的載體、目的基因和骨架的長度分別為6412bp, 864bp和5548bp,其兩個酶切位點分別為EcoRl和勵以具有氨芐青霉素抗性, N末端融合有His6標(biāo)簽。質(zhì)粒DNA測序結(jié)果表明,插入的hPPA腳.LBD的cDNA基因序列與GeneBank 公布的序列洲M.138712完全相符,閱讀框沒有發(fā)生移碼,融合表達(dá)載體構(gòu)建成功。 (注:該部分工作由廣州復(fù)能基因有限公司完成。(1將100山感受態(tài)細(xì)菌E.coli BL21(DE3置于冰浴條件下融化,加入10山 含pReceiver-B01-hPPAR7,LBD質(zhì)粒的溶液,緩慢旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物,在冰 浴中放置30mi

39、n。(2將離心管于42水浴中熱休克90S,然后快速轉(zhuǎn)移至冰浴中,使細(xì)菌冷 卻3rain。16重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文(3向離心管中加入900“l(fā) LB液體培養(yǎng)基,混勻后于37恒溫振蕩儀中以 200rpm速度振蕩培養(yǎng)45min,使細(xì)菌復(fù)蘇。(4混勻離心管內(nèi)容物,吸取100ttl菌液均勻涂布于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng) 基上,室溫下放置10min,待菌液被完全吸收后,將平板倒置于37恒溫培養(yǎng)箱 中過夜培養(yǎng)1216h至單菌落形成。用Plasmid Mini kit l抽提質(zhì)粒,抽提步驟參照該試劑盒說明書。(試劑盒內(nèi)裝 有HiBind Miniprep柱、溶液l/RNase A、溶液Il、溶液II

40、I、HB緩沖液和DNA Wash 緩沖液等。(1從平板上挑取單克隆菌落(DH5a/pReceiver-B01-hPPAR7.LBD,接種于無 菌的LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基中,于37恒溫振蕩儀中以250rpm速度振蕩培 養(yǎng)過夜。(3向留有菌體沉淀的離心管中加入250山溶液I/RNase A,用移液器徹底重 懸茵體沉淀。(4向離心管中加入250111溶液II,傾斜45。角,順一個方向,慢慢旋轉(zhuǎn)離心 管混勻至溶液透明粘稠,室溫下靜置2min。(5向離心管中加入350pl溶液Ill,立刻溫和顛倒離心管數(shù)次至出現(xiàn)大量白 色絮狀沉淀后,于室溫下靜置2min。(612000rpm條件下離心10rain。(

41、7小心將離心得到的上清液轉(zhuǎn)移到帶有原裝收集管的潔凈HiBind Miniprep 柱中,室溫條件下放置12min,10000rpm離心l min,倒掉收集管中的廢液,將 柱子重放回收集管中。(8向柱中加入500lxl HB緩沖液,10000rpm條件下離心l min,倒掉收集管 中的廢液,將柱重放回收集管中。(9向柱中加入700lai稀釋過的DNA Wash緩沖液,10000rpm條件下離心l min,倒掉收集管中的廢液,將柱子重放回收集管中。17重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文(10重復(fù)操作(9一次,倒掉廢液后,將柱子重新放回收集管中,13000rpm離 心2min以盡量除去殘留的溶液DNA

42、Wash緩沖液。(11小心取出柱子,將其套入一個潔凈的1.5mL離心管中,在柱的膜中央加 入70LLl無菌水,室溫放置2min后,12000rpm條件下離心2min。離心管內(nèi)洗脫 出的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA。(12做好標(biāo)記,于.20保存。于LB/氨芐青霉素固體培養(yǎng)基上挑選單克隆茵落,接種至無菌的LB像芐青霉 素液體培養(yǎng)基中,將此培養(yǎng)基置于37恒溫振蕩儀中,以250rpm速度振蕩培養(yǎng) 過夜。再將培養(yǎng)后的茵液按l:50的比例接種到新鮮的LB/氨芐青霉素液體培養(yǎng)基 中,于37恒溫振蕩儀中,以200rpm速度振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.30.4,加入 IPTG,待細(xì)菌表達(dá)后,4、12000rpm條

43、件下離心5min,棄去上清液,茵體用 低溫洗滌緩沖液洗滌3次,保存于.80下。經(jīng)過對hPPARV.LBD重組蛋白的表達(dá)條件研究,發(fā)現(xiàn)在常規(guī)條件不能得到具 有生物學(xué)功能的重組蛋白。為提高h(yuǎn)PPARV.LBD重組蛋白的產(chǎn)量和增大其溶解性, 本文分別對誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。按2.2-3項下方法,于加入IPTG至相同終濃度后,考察在誘導(dǎo)溫度和時間分 別為:37(6h、30(8h、25"C(12h、16"C(20h等條件下”PARV-LBD重 組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。取各組菌液l mL離心收集菌體,經(jīng)處理后進(jìn)行12%SDS.PAGE 分析,結(jié)果如圖1.2所示。重

44、慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì);l,3,5和7:分別為在37、30、 25和16時全細(xì)菌裂解液的沉淀;2,4,6和8:分 別為在37、30.25和16時全細(xì)菌裂解液的上清液。M:Standard protein Marker;1,3,5and 7:cell lysates pellet at 37,30,25and 16"C respectively;2,4,6and 8: cell Iysams supernatant at 37,30,25and 16。C respectively.圖1-2不同誘導(dǎo)溫度下表達(dá)的hPPAR丫-LBD重組蛋白SDS.PAGE圖Fig.12

45、SDS-PAGE profileof hPPAR?-LBD recombinant protein expressed at different induction temperatures由圖1.2可見,可溶性”PAR7.LBD重組蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)溫度降低而逐 漸增多。高溫時,重組蛋白以包涵體的形式存在。在低溫16時,上清液中含有 大量的可溶性hPPA腳.LBD重組蛋白,對SDS.PAGE條帶灰度進(jìn)行分析顯示,可 溶性目標(biāo)重組蛋白(超聲破碎上清液中約占總蛋白的50%,這表明低溫有利于可溶 性hPPAR丫.LBD重組蛋白的表達(dá),故選用16為該蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)溫度。2242IPTG濃度對重組蛋白

46、表達(dá)的影響kDa M l 234,6940 66.245.0 35.1 26.020.0 J4.4 j,翻,。 ?,1k I kl, 7。分享詞:鍪二。三二iM:Standard protein Marker;l:cell lysates before inducation;2-6: cell lysates induced with different concentration of IPTG(0,0.2, 0.4,0.6and 0.8mmol/L.圖1-3不同IPTG濃度下表達(dá)的hPPAR丫-LBD重組蛋白SDS-PAGE圖Fig.1-3SDS-PAGE profile of hPPAR

47、T-LBD recombinant protein expressed with different concentratiOIlS of IPTG重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文kDa M I 940-窶 舶.2-一45.0,3,.0.-整 26.O,200,墼 14-4: 234S7R 1Ifl鼉器墨墨一-J一-q-”-I. ,I“躺赫I 一一一緲一暨I:縊_潼I自醯齲婦女搿Ik馘i。,J;麓譬薯謄黲.疊誓誓M:Standard protein Marker;l:controlled cell lysates;2:cell lysates before IPTG inducation;310

48、:cell lysates after induced with 0.6mmol/L IPTG at 16for 10,12,14,16, 18,20,22and 24h,respectively.圖1-4不同誘導(dǎo)時間下表達(dá)的hPPAR丫-LBD重組蛋白SOS-PAGE圖Fig.1-4SDS-PAGE profile of hPPAR丫-LBD recombinant protein expressed for different induction time由圖l-4可見,隨著誘導(dǎo)時間的增加,重組蛋白的表達(dá)量也增多。當(dāng)誘導(dǎo)時間 為20h時,可獲得最大量的hPPARV.LBD重組蛋白。對SDS

49、.PAGE條帶灰度進(jìn)行 分析顯示,其重組蛋白約占菌體總蛋白的60%。但當(dāng)誘導(dǎo)時間超過20h后,其表 達(dá)量又逐漸降低。故將誘導(dǎo)表達(dá)時間設(shè)為20h。綜上所述,通過優(yōu)化得到的”PARV.LBD重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件為:誘導(dǎo)溫 度為16,PTG濃度為0.6mmol/L,誘導(dǎo)時間為20h。在此條件下,能較好地 表達(dá)可溶性的hPPA腳.LBD重組蛋白。2.3細(xì)菌破碎取.80下保存的菌體,室溫條件下融化后,按l g:25mL比例加入細(xì)菌裂解 緩沖液,懸浮菌體。攪拌,于4靜置30rain。然后,將該裂解液置于冰浴中在 功率90W,超聲5S,停5S條件下超聲約300次,待溶液變澄清后,于4、12000 rpm條件

50、下離心40rain,分別收集上清液和沉淀,進(jìn)行12%SDS.PAGE分析。并重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文將上清液用0.22lam微孔濾膜過濾,.80下保存?zhèn)溆谩?1按說明書裝好蛋白垂直電泳槽并用瓊脂封閉周圍間隙。(3待分離膠完全聚合后,倒去覆蓋的水,用超純水洗滌凝膠頂數(shù)次以除去未 聚合的丙烯酰胺,盡可能的排去凝膠層項的液體。(5將樣品與蛋白電泳上樣緩沖液混勻,并煮沸5min;(6待濃縮膠聚合完全后,小心拔出加樣梳,用電泳緩沖液沖洗加樣孔以除去 未聚合的丙烯酰胺,向電泳槽中加入lxTris.甘氨酸電泳緩沖液,按需要體積取樣, 依次加入加樣孔中。(7連接電泳裝置與電源,以100V電壓電泳。(8當(dāng)

51、電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠底部時,關(guān)閉電源停止電泳,取出電泳 凝膠,置于玻璃皿中,加入固定液,在電泳振蕩儀上緩慢振蕩l h。(9棄去固定液,加入60的考馬斯亮藍(lán)R.250染色液,在電泳振蕩儀上緩 慢振蕩染色30min。(10棄去染色液,向平皿中加入脫色液,于電泳振蕩儀上緩慢振蕩脫色至背 景清晰,觀察蛋白條帶,并拍照留作實驗記錄。(11將凝膠沖洗干凈后,浸入無菌水中保存于4冰箱中。3討論細(xì)菌表達(dá)外源性蛋白質(zhì)時,目標(biāo)重組蛋白經(jīng)常會形成無生物活性的包涵體,重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文本部分所建立的方法能成功用于具有生物學(xué)功能的可溶性hPPARS.LBD重組 蛋白的表達(dá)。通過優(yōu)化細(xì)菌生長條件,實現(xiàn)

52、了大腸桿菌中可溶性hPPARr.LBD重 組蛋白的表達(dá),經(jīng)SDS.PAGE電泳檢測,在32kDa處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶,分析 鑒定其為目標(biāo)重組蛋白,其產(chǎn)量比文獻(xiàn)方法120,211高2倍,可溶性的重組蛋白(超聲 破碎上清液中占總蛋白約60%。重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第二部分hPPAR7.LBD重組蛋白的純化本部分主要基于His6融合表達(dá)系統(tǒng)采用Ni2+親和色譜法進(jìn)行蛋白純化,以獲 取具有良好生物學(xué)功能的可溶性hPPA腳一LBD重組蛋白。1實驗材料1.1主要試劑牛血清白蛋白(批號:738328考馬斯亮藍(lán)G.250(批號:20071110HisLink protein purification

53、resin(批號:V2883 羥乙基哌嗪乙磺酸(批號090814127咪唑(分裝Sigma Promega公司 Merck公司 Merck公司(1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液精密稱取結(jié)晶牛血清白蛋I蘭I(BSA0.01079,溶于10mL超純水,配制成濃度 約為1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。(2考馬斯亮藍(lán)G.250染液稱取考馬斯亮藍(lán)G一250100mg,量取95%乙醇50mL、85%磷酸100mL,攪 拌溶解后,再加入適量超純水,配制成1000mL的考馬斯亮藍(lán)G.250染液,用濾 紙過濾。23重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文分別稱取羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES、咪唑(imidazoIe和NaCI適量,并調(diào)

54、節(jié) 溶液的pH值,配制成HEPES濃度為100mmol/L,imidazole濃度為10mmol/L, NaCI濃度為300mmol/L,pH值為7.5的平衡緩沖液。分別稱取HEPES、imidazole和NaC!適量,并調(diào)節(jié)溶液的pH值,配制成HEPES 濃度為100mmoi/L,imidazole濃度為100mmol/L,NaCI濃度為300mmol/L,pH 值為7.5的洗滌緩沖液。分別稱取HEPES、imidazole和NaC!適量,并調(diào)節(jié)溶液的pH值,配制成HEPES 濃度為100mmoi/L,imidazole濃度為500mmol/L,NaCI濃度為300mmol/L,pH 值為7.5的洗脫緩沖液。1.3主要儀器設(shè)備本部分所用的儀器設(shè)備見第一部分實驗材料l-3項。2方法