八氯二丙醚對體外培養(yǎng)CHL細胞DNA合成影響

1、    八氯二丙醚對體外培養(yǎng)CHL細胞DNA合成影響            作者：曾垂煥，唐萌，熊麗林時間：2007-11-22 11:05:00                     【摘要】  目的 研究八氯二丙醚對體外培養(yǎng)

2、中國倉鼠肺細胞(CHL)DNA合成影響。方法 采用DNA熒光定量測定方法,觀察不同染毒濃度(0250，0187，0125，0062，0046，0031g/ml)對CHL細胞DNA合成影響。結(jié)果 八氯二丙醚濃度為0062，0046g/ml時DNA合成量與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表現(xiàn)為合成增加(P<005)，濃度為0250，0187，0125g/ml時，則表現(xiàn)為合成抑制(P<005)，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P<005)；0250g/ml濃度在脫離染毒后2，4，6，12h內(nèi)DNA合成量持續(xù)下降。結(jié)論 在低濃度時(0062，0046g/ml)，八氯二丙醚可引起CHL細胞DNA合成能力

3、增加,而在高濃度時(0250，0187，0125g/ml)則表現(xiàn)為DNA合成抑制，且這種抑制由DNA損傷引起。 【關(guān)鍵詞】  八氯二丙醚八氯二丙醚(Octachlorodipropyl ether，S2)化學(xué)名為2，3，3，3，2，3，3，3八氯二丙醚。S2作為農(nóng)藥的增效劑，可以明顯提高擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類藥物的殺蟲效果1。已有研究表明，體外實驗中S2為可疑致突變物，并且體外可直接導(dǎo)致小牛胸腺DNA交聯(lián)率增加2-5。體內(nèi)實驗表明，S2蚊香煙霧對小鼠肺細胞和睪丸細胞的DNA合成有抑制作用6。本文采用DNA熒光定量測定方法，觀察S2不同染毒濃度對CHL細胞DNA合成影響，以進一步探討

4、其遺傳毒性。1  材料與方法11  材料111  儀器  熒光分光光度計(美國Crary eslipse公司)；低溫冷凍離心機(美國Sigma公司)；水浴鍋、渦旋器。112  試劑  八氯二丙醚(江都恒生化工有限公司),純度>93%，分子量3770，比重162，雜質(zhì)含量，H2SO4<01%,HCl<005%；Hoechst33258熒光染料,小牛胸腺DNA(美國Sigma公司)，其他試劑均為分析純。113  細胞株及培養(yǎng)條件  中國倉鼠肺細胞株(CHL)(江蘇省藥物檢驗所)，用含10%新生小牛血清

5、(杭州四季青生物工程材料有限公司)、100U青霉素、谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO),于37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代,取生長良好的細胞用于實驗。12  方法121  S2對CHL細胞的半數(shù)致死濃度(IC50)實驗  在96孔培養(yǎng)板上接種CHL細胞，每孔100l，接種密度為1×105/孔，培養(yǎng)24h后每孔加入不同濃度的S2溶液，各劑量組終濃度分別為0，1，2，4，8，32，64g/ml，每個劑量組設(shè)定6個平行孔。染毒24h后棄去每孔中的培養(yǎng)液，加入含10%四甲基偶氮噻唑藍(MTT)5mg/ml的RPMI1640培養(yǎng)液(不含小牛血清)，繼

6、續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去MTT溶液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100l后用酶標儀測定各孔在570nm波長處的吸光度(A)值。Bliss法計算IC50,并測得細胞存活率95%的S2濃度。122  S2對CHL細胞DNA合成影響的測定  取生長良好的細胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔2ml，接種密度為07×106/孔,培養(yǎng)24h后每孔加入不同濃度的S2溶液，溶劑對照組濃度分別為0031，0046，0062，0187，0250g/ml，每個劑量組設(shè)定6個平行孔,染毒24h后，參照Domas TR等7,Brunk CF等8方法及陸瑛等9介紹的方法改進,測定每組的DNA含量。其方法

7、為在每一測量樣本中加入熒光緩沖劑(No33258),并在熒光分光光度計下讀數(shù)。其激發(fā)波長為365nm,發(fā)射波長為458nm。對照參數(shù)為小牛胸腺DNA的標準曲線。13  統(tǒng)計分析  采用SAS 801軟件進行方差分析及Dunnett't檢驗。2  結(jié)果21  S2對CHL細胞的IC50測定結(jié)果  由于S2難溶于水，為配成準確的濃度系列，我們采用少量的乙醇作為溶劑，為此先對乙醇的毒性進行測定。結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度04%時,細胞的生長不隨其含量增加而變化,通過對各濃度組之間的A570值進行比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>005)。當(dāng)乙醇濃度

8、04%時,細胞的A570值降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005)，故進行IC50及DNA合成影響的測定時使用的乙醇濃度<04%，用Bliss法求得S2的IC50為5478g/ml，95%CI=42777015g/ml，細胞存活率95%的最高S2濃度為05g/ml(表1)。表1  S2的IC50測定結(jié)果（略）22  S2對CHL細胞DNA合成影響的測定221  DNA濃度與熒光強度關(guān)系的標準曲線(表2)  結(jié)果表明，DNA含量在242483582ng/ml之間時,二者有良好的線性關(guān)系。故染毒結(jié)束收獲細胞進行測定時，各組被測細胞數(shù)均取1×

9、;106個左右，使其靈敏度能滿足本實驗的要求。相關(guān)系數(shù)r=0990,回歸方程為y=02127x+25602。經(jīng)檢驗，r值及回歸方程的斜率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表2  DNA濃度與熒光強度的關(guān)系（略）222  S2對CHL細胞DNA合成影響(表3)  結(jié)果顯示，S2濃度在00310046g/ml時，DNA合成量處于增加趨勢，其中0046，0062g/ml濃度組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005)，表現(xiàn)為合成增加。濃度在0250，0187，0125g/ml時則表現(xiàn)為合成抑制(P<005)，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P<005)(圖1)。表3 

10、 不同濃度組相對于對照組DNA的增殖率（略）223  DNA合成受到抑制后的修復(fù)情況  為進一步觀察DNA合成受到抑制后的修復(fù)情況，選擇0250g/ml組，在脫離染毒后2，4，6，12h內(nèi)觀察其DNA合成情況，結(jié)果表明，脫離染毒后4、6、12h內(nèi)與0h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<005)(圖2)。圖1  不同濃度S2染毒24h后，CHL細胞DNA合成情況（略）圖2  0250g/ml組脫離染毒后不同時間段DNA合成情況（略）3  討論在增殖性的細胞群體中，程序外DNA合成(UDS)只有半保留DNA合成水平的1%5%10。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)S2的

11、濃度在00310062g/ml之間染毒24h時，細胞的DNA合成處于增加趨勢，提示細胞DNA合成可能在受到抑制前有一個代償性升高階段，其中0062，0046g/ml濃度組已經(jīng)大大超出了1%5%水平，由此推測這些濃度組染毒時所產(chǎn)生的DNA合成量增加是UDS增加所造成。提示在這些濃度下，可能已經(jīng)引起DNA損傷，導(dǎo)致細胞修復(fù)DNA的能力增強，隨著染毒濃度的加大，造成半保留DNA合成抑制，出現(xiàn)DNA合成大量下降，且0250g/ml濃度在脫離接觸后的212h出現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，表明雖然已經(jīng)脫離S2接觸，但由于損傷依然存在，DNA合成量仍然持續(xù)下降，因此，認為S2所造成的這種抑制是通過DNA損傷引起的，而

12、不是通過代謝阻斷途徑而呈現(xiàn)出DNA合成抑制作用，這與已對S2引起DNA損傷的研究結(jié)果較為一致，即在一定劑量范圍內(nèi)，S2吸入可引起小鼠DNA損傷11。體外實驗也可導(dǎo)致小牛胸腺DNA交聯(lián)率增加12，染色體畸變實驗為陽性13。 【參考文獻】  1 陳學(xué)文.八氯二丙醚的使用J.蚊香通訊,1990,6(2):9.2 李純德,唐萌,談偉君,等.八氯二丙醚的急性毒性及誘變性研究J.中國公共衛(wèi)生學(xué)報,1993,12(3):192.3 唐萌,林大榕,談偉君,等.八氯二丙醚及其蚊香煙霧的毒理學(xué)研究J.中國媒介生物學(xué)及控制雜志,1992,3(5):263-267.4 唐萌,張徐軍.八氯二丙醚遺傳

13、毒性研究J.衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,1992,27(6):386-387.5 談偉君,唐萌,虞秀珍,等.八氯二丙醚的致突變性和致畸性研究J.環(huán)境與健康雜志,1997,14(3):107-109.6 唐萌,談偉君,李純德,等.S2蚊香煙霧對小鼠細胞DNA合成的影響急性毒性J.南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報,1993,12(2):87-89.7 Downs TR,Wilfinger WW.Fluorimetric quantification of DNA in cells and tissueJ.Analytical Biochemistry,1983,131(2):538-547.8 Brunk CF,Jones KC,James TW.Assay for nanogram quantities of DNA in cellular homogenatesJ.Anal Biochem,1979,92(2):497-500.9 陸瑛,李泳鵑,楊榮.苯對體培養(yǎng)細胞DNA合成的影響J.職業(yè)衛(wèi)生與病傷,1994,9(2):65-67.10 非程序