流式細(xì)胞儀常用的幾種檢測方法

1、流式細(xì)胞儀常用的幾種檢測方法（轉(zhuǎn)載）、測定用乙醇固定的 DNA的含量1、培養(yǎng)細(xì)胞的DNA含量的測定制備單細(xì)胞懸液于 200 1的PBS緩沖液中;加入2ml預(yù)冷的70%乙醇，4C保存；附：細(xì)胞固定的一般步驟4)1)2)取單細(xì)胞懸液 12X 106個(gè)細(xì)胞于 PBS（ PH=7.2）緩沖液中;300g離心5分鐘，棄上清，反復(fù)兩次；3）重懸細(xì)胞于0.5ml PBS緩沖液中；將細(xì)胞懸液放置于 23ml冷70%乙醇中，混勻，保存于鐘。在4 C條件下可保存 23周。4C,至少30分1)2)注意:根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求，固定劑也可選用13%多聚甲醛;將乙醇作為固定劑時(shí)，乙醇應(yīng)預(yù)冷至04C;細(xì)胞在固定時(shí)，固定齊換緩慢滴

2、入細(xì)胞懸液中，使固定劑的濃度緩慢增加,并不斷震搖，以免細(xì)胞成團(tuán)（特別是用乙醇固定時(shí)）。300g離心5分鐘，去上清，再重懸于 400卩l(xiāng) PBS 中;顯微鏡下觀察，若有明顯的黏附，須再用篩網(wǎng)過濾;加入PI （含Rnase），避光孵育30分鐘;上機(jī)檢測。2、新鮮組織的DNA含量的測定4)1)3)3)4)2)用200mg濕重組織用機(jī)械法制成單細(xì)胞懸液；500g離心5分鐘；棄上清，重懸于10ml染色-去污劑中；再過濾，用200目的篩網(wǎng)或7080ym的篩網(wǎng)過濾;上機(jī)檢測。5）3、石蠟包埋組織切片的從石蠟包埋切取切片 50DNA含量的測定ym厚，23片，制成單細(xì)胞懸液; 500g離心5分鐘，棄上清；加入P

3、I液1ml室溫避光30分鐘；調(diào)整細(xì)胞濃度為 1X 106/ml;上機(jī)檢測。用PBS緩沖液洗滌,5）二、細(xì)胞凋亡檢測及相關(guān)分子檢測1、細(xì)胞DNA含量分布（由細(xì)胞 DNA降解方式檢測細(xì)胞凋亡）222、b)3)5)1)2)1 x Binding Bufferd)e)4)3)6)收集已固定的單細(xì)胞懸液約5X 1051X 106/ml ;離心除去固定液，3ml PBS重懸細(xì)胞；1500rpm離心，5分鐘，棄去PBS加PI染液1ml，室溫避光20分鐘；調(diào)整細(xì)胞濃度 5x 105/ml ;上機(jī)檢測。磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細(xì)胞凋亡常規(guī)制備單細(xì)胞懸液，用PBS洗兩次.(若為全血要先血),取約5X 106個(gè)細(xì)胞

4、，1500rpm 離心，棄上清，用40011 1 x Binding Buffer重懸；分成a、b、c、d、e五管，每管約1 x 106個(gè)細(xì)胞a)陰性對照，不加任何試劑；陽性對照，加2%多聚甲醛固定 30分鐘，加AnnexinV 5 11,室溫10min,用次，棄上清再加19011緩沖液、1011 PI 避光15分鐘加1011 PI，避光孵育15分鐘；c)力口 5卩l(xiāng) AnnexinV 液，室溫避光孵育15min;加10卩l(xiāng) PI 和5卩l(xiāng) AnnexinV 液，室溫避光孵育 5min ;每管各加 4001 1, x Bin di ng Buffer 。上機(jī)檢測。4)a.操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿

5、用力吹打細(xì)胞;b.操作時(shí)注意避光；c.反應(yīng)完畢后盡快檢測，最好在一小時(shí)內(nèi)檢測。3、用單克隆抗體APO2.7檢測細(xì)胞凋亡注意1)2)放置0.51 x 106個(gè)細(xì)胞到試管中;室溫離心 200g, 6min;棄上清，加入1001 冷的(4C)在PBSF溶液中含1001 g/ml的digitonnin , 輕輕地重懸細(xì)胞，在冰上孵育20mi n;加入2ml冷的(4C) PBSF液，室溫離心 200g, 6min；棄上清，加入 2011 PE標(biāo)記的Apo2.7單克隆抗體和8011 PBSF液，用7)8)vortex輕輕震蕩，室溫避光孵育15分鐘；加入2ml PBSF液，室溫離心 200g , 6min

6、;棄上清，加入1ml PBSF液重懸細(xì)胞；避光保存，直到流式細(xì)胞儀檢測。PBSF 含 2.5% FCS (v/v )禾口 0.01%NaN3( w/v )的 PBS三、用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行 DNA周期分析1、方法：同DNA含量檢測2、注意:單細(xì)胞濃度應(yīng)約106/ml，以免影響檢測的 CV值和檢測結(jié)果；制備完成后的標(biāo)本應(yīng)用光學(xué)顯微鏡檢查其質(zhì)量(如細(xì)胞是否聚集或過多碎片)，以保證得 到足夠的細(xì)胞含量；醛類固定會(huì)影響PI與核酸的結(jié)合。四、免疫熒光標(biāo)記法1、細(xì)胞膜上的免疫熒光檢測法間接標(biāo)記法1) 制備單細(xì)胞懸液；2) 細(xì)胞計(jì)數(shù)，取出1X 106個(gè)細(xì)胞于試管中；3) 用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)活細(xì)胞數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù)&g

7、t;9095%4) 在試管中加入一抗，(劑量按照說明書的要求)，孵育 3060分鐘；5) PBS洗滌12次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；6) 加入二抗，孵育 2030分鐘；7) PBS洗一次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；8) 加300卩l(xiāng) PBS，上機(jī)檢測(若不能及時(shí)上機(jī)檢測，可加1ml 1%多聚甲醛固定，可放置1周)。直接標(biāo)記法同間接標(biāo)記法 在試管中加入熒光標(biāo)記的抗體，混勻，孵育30分鐘； 用PBS洗2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清； 加300卩l(xiāng) PBS(PH=7.4)，上機(jī)檢測。2、細(xì)胞膜內(nèi)的免疫熒光標(biāo)記法間接免疫熒光標(biāo)記法1) 取已制備好的單細(xì)胞懸液，用13%勺

8、多聚甲醛固定30分鐘(也可4C保存過夜)；2) 用PBS洗兩次，棄上清；3) 細(xì)胞膜打孔，加入 0.1%皂素200卩l(xiāng)，室溫10分鐘；4) 用PBS洗滌兩次；5) 加入第一抗體，室溫 3060分鐘，或4C過夜，同時(shí)須設(shè)陰性對照或同型對照管；6) 用PBS洗滌兩次；7) 加入二抗(熒光標(biāo)記的抗體)室溫 20分鐘，避光；8) 用PBS洗滌12次，棄上清；9) 重懸細(xì)胞于500卩l(xiāng)PBS中，上機(jī)檢測。直接熒光標(biāo)記法同間接熒光標(biāo)記法；加入熒光素標(biāo)記好的抗體，避光30分鐘(同時(shí)做同型對照管)；用PBS洗滌12次，棄上清；加300卩I PBS上機(jī)檢測。細(xì)胞膜上及細(xì)胞內(nèi)雙標(biāo)記法(直標(biāo)法)1) 取出已制備好的

9、未固定的單細(xì)胞懸液1X 10 6個(gè)細(xì)胞于試管中;2) 用PBS洗滌兩次；3) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體來標(biāo)記細(xì)胞膜上的抗原，同時(shí)加上陰性對照管，室溫孵育20分鐘；4) 在試管中加入1%3%多聚甲醛1ml，固定30分鐘；5) PBS洗滌兩次1500rpm 3分鐘，棄上清；6) 打孔，加入0.1 %皂素200 1室溫10分鐘；7) 用PBS洗滌兩次，棄上清；8) 加入用熒光素標(biāo)記的抗體，標(biāo)記膜內(nèi)的抗原(標(biāo)記膜內(nèi)的抗體的熒光素的顏色與膜上標(biāo)記的熒光素的顏色務(wù)必不相同)室溫20分鐘孵育；9) 用PBS洗一遍棄上清；10) 用300卩IPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測五、流式細(xì)胞術(shù)中的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：1、對照組的設(shè)

10、置：在流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量都是相對值，不是絕對值。如需知道絕對值時(shí)必須 設(shè)置對照組樣品。對照組樣品包括有陰性對照和陽性對照。(1)、陰性對照的設(shè)置2在實(shí)驗(yàn)過程中，如做間接標(biāo)記法，可設(shè)置與一抗無關(guān)的實(shí)驗(yàn)，即在實(shí)驗(yàn)中不加一抗而只加上帶有熒光標(biāo)記的第二抗體作為陰性對照管，作為陰性對照。2在實(shí)驗(yàn)過程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可設(shè)置理論上的陰性細(xì)胞作為陰性對照管，實(shí)驗(yàn)過程及步驟與實(shí)驗(yàn)組務(wù)必相同。(做間接標(biāo)記法時(shí)，同樣也可同時(shí)設(shè)置“陰性細(xì) 胞”的陰性對照管作為陰性對照。2在實(shí)驗(yàn)過程中，假設(shè)做直接標(biāo)記法，可將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，取一管，加上與實(shí)驗(yàn)抗體所標(biāo)記的熒光顏色相同的同型對照來作為陰性對照。(2)、陽性對照的設(shè)置：在實(shí)驗(yàn)過程中如涉及到表達(dá)缺失或減少的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)設(shè)置陽性對照組，其設(shè)置方法與陰性對 照設(shè)置相同。2、幾點(diǎn)建議：1) 在實(shí)驗(yàn)過程中，在保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量減少實(shí)驗(yàn)工序和過程。由于間接標(biāo)記法的工序多，實(shí)驗(yàn)過程長，如再加之操作的不熟練，細(xì)胞更容易 丟失和受損，而造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。因此，在條件允許的范圍內(nèi)，建議盡量做直接標(biāo)記法而不去做間接標(biāo)記法，以