急性髓系白血病骨髓細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)中的纖維組織的動(dòng)態(tài)變化

1、急性髓系白血病骨髓細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)中的纖維組織的動(dòng)態(tài)變化摘要目的和方法：為探討急性髓系白血病細(xì)胞外基質(zhì)纖維組織的動(dòng)態(tài)變化對(duì)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)可能產(chǎn)生的影響。應(yīng)用倒置顯微鏡及病理特殊染色(Gomori & Masson)觀察15例AML骨髓細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)(LTBMC)貼壁層融合及網(wǎng)狀纖維、膠原纖維含量(半定量法)的變化。結(jié)果：(1)8/15例獲獨(dú)立生長(zhǎng)的AML(AMLsm)在培養(yǎng)的18周網(wǎng)狀纖維含量顯著低于正常對(duì)照和未獲獨(dú)立生長(zhǎng)的AML(AMLnsm)(P0.05)。而AMLsm的膠原纖維含量在培養(yǎng)的16周顯著高于正常對(duì)照和AMLnsm(P0.05)；(2)膠原豐富區(qū)域見大量造血細(xì)胞，而網(wǎng)狀纖維密集區(qū)

2、造血細(xì)胞稀少。(3)培養(yǎng)過程中貼壁層呈大部分融合的僅見于3例AMLsm。結(jié)論：適量的纖維組織是造血細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的，而其組成比例異常可能在白血病及其它一些惡性血液病的發(fā)生上起一定的作用。主題詞骨髓；細(xì)胞，培養(yǎng)的；白血病，髓樣；膠原中國分類號(hào)R733.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)01-0063-04 Dynamic change of the reticulin fibres and collagen fibres in vitro long-term bone marrow culture of acute myeloid leukemiaLIN Yan-juan, L

3、U Lian-huang, CHEN Zhi-zhe, LI Jue-min, ZHANG Ping-rong(Fujian Institute of Hematology, Union Hospital Affiliated Fujian Medical University, Fuzhou 350001，China)AbstractAIM and METHOD: The relationship between the evolution of the reticulin fibres(RF) or the collagen fibres(CF) and the growing of he

4、matopoietic cells in long-term bone marrow culture (LTBMC) from 15 paticnts with acute myeloid leukemia (AML) and form 6 normal subjects was observed by inverted microscope, Gomori?s staining and Masson?s staining were used. RESULTS: (1)The amount of RF contents of 8 AMLs,with self- maintained(AMLsm

5、) in the 18 weeks-old-culture was significant less than that of normal control and 7 AMLs,without self-maintained(AMLnsm) (P0.05). On the contrary,the amount of CF coutents of AMLsm in the 16 weeks-old-culture was significant more than that of normal and AMLnsm(P0.05). (2) There were many hematopoie

6、tic cells in the areas of CF, and there were few in the areas of RF. (3)During the whole culture, the most part of confluence of the adherent layer only observed in 3 AMLsm. CONCLUSION: A proper amounts of fibres in the extracellular matrixes of bone marrow is necessary for hematopoiesis, but the ch

7、ange of the proportion of RF contents to CF contents may play an important role in the development of AML and other malignant blood diseases.MeSHBone marrow; Cells, cultured; Leukemia, myeloid; Collagen近年來研究表明白血病造血微環(huán)境存在異常，其中纖維組織增生日益受到關(guān)注13。但對(duì)其異常的原因尚無明確的解釋。本文通過對(duì)急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)骨髓細(xì)胞

8、的長(zhǎng)期培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察它們貼壁層纖維組織：網(wǎng)狀纖維(reticulin fibres, RF)和膠原纖維(collagen fibres, CF)含量(半定量法)及分布的演變過程。旨在了解纖維組織作為骨髓細(xì)胞外基質(zhì)的一大成份，其消長(zhǎng)變化在白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中可能產(chǎn)生的影響。材料和方法一、骨髓細(xì)胞來源：15例初治AML均符合法、美、英(France, American and Britain, FAB)3國協(xié)作組的診斷標(biāo)準(zhǔn)。男10例，女5例，中位年齡25(1455)歲。AML中M1 1例，M23例，M32例，M59例。健康志愿者6例，中位年齡36(2552)歲。骨髓細(xì)胞標(biāo)本均取自髂后上棘。二、骨

9、髓細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)(LTBMC)方法4：培養(yǎng)至7、8周后，懸浮細(xì)胞增多的病例，按2106/mL濃度將懸浮細(xì)胞移種于上述相同培養(yǎng)體系中，能繼續(xù)傳代不斷生長(zhǎng)者認(rèn)為是獲獨(dú)立生長(zhǎng)(self-maintainted,SM)。三、貼壁層融合觀察：倒置顯微鏡下每周動(dòng)態(tài)觀察貼壁層纖維細(xì)胞生長(zhǎng)、融合程度。融合判斷標(biāo)準(zhǔn)：完全融合(占孔底面積3/4以上)；大部分融合(占孔底面積1/2-3/4)，小部分融合(占孔底面積1/2以下)。四、貼壁層RF、CF染色、分級(jí)定量法：(1)標(biāo)本取自培養(yǎng)的第1,2,3,4,6,8周事先置孔底的蓋玻片(貼壁層)用0.01 mol/L,pH 7.2的PBS輕漂洗2次后，分別用10甲醛液或Bo

10、uin氏液固定。(2)Gomori染色5：用10甲醛液固定標(biāo)本染色觀察網(wǎng)狀纖維。(3)Masson染色5：用Bouin氏液固定標(biāo)本染色觀察膠原纖維。(4)RF、CF分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照Manoharan等改良法6略加修改，簡(jiǎn)述如下：RF分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：(-)無黑色纖維；(+)小部分區(qū)域*有纖細(xì)纖維網(wǎng)絡(luò)；(+)大部分區(qū)域*細(xì)纖維網(wǎng)絡(luò)和或有少許*粗纖維；(+)大部分區(qū)域細(xì)纖維網(wǎng)絡(luò)，且有小部分區(qū)域粗纖維；(+)大部分區(qū)域或彌漫*的粗纖維網(wǎng)絡(luò)。CF分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：(-)無綠色纖維；(+)有少許*綠色纖維；(+)小部分區(qū)域*的綠色纖維；(+)大部分區(qū)域*的綠色纖維；(+)彌漫的綠色或深綠色纖維。*注：以一個(gè)高倍視野(401

11、0倍)為一個(gè)區(qū)域，“少許”指1/4視野以下；“小部分區(qū)域”指1/41/2視野，“大部分區(qū)域”指1/2-3/4視野，“彌漫”指3/4至布滿整個(gè)視野。(5)含量以半定量積分計(jì)算法：共對(duì)200個(gè)高倍視野(1040倍)分級(jí)，平均計(jì)算100個(gè)視野的積分量(陽性指數(shù))。并觀察RF、CF分布及其與造血細(xì)胞粘附的動(dòng)態(tài)變化。五、統(tǒng)計(jì)方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差形式表達(dá)。顯著性檢驗(yàn)用方差分析，q檢驗(yàn)。結(jié)果一、AML及正常對(duì)照細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)：(1)每周半量換液前計(jì)數(shù)懸浮細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)于培養(yǎng)6至8周后8/15例AML懸浮細(xì)胞數(shù)漸增加，最終獲獨(dú)立生長(zhǎng)(AMLsm)，另7/15例AML和6例正常對(duì)照未獲獨(dú)立生長(zhǎng)(AMLnsm)，其

12、懸浮細(xì)胞數(shù)明顯減少而不能維持生長(zhǎng)。(2)觀察貼壁層融合程度和時(shí)間：發(fā)現(xiàn)6例正常對(duì)照均于培養(yǎng)的34周完全融合；AML中8例于培養(yǎng)的23周完全融合(其中AMLsm 3例，于培養(yǎng)的58周轉(zhuǎn)為大部分融合)，3例為大部分融合，僅見于AMLsm，4例為小部分融合。8周后AMLsm的貼壁基質(zhì)融合層隨造血細(xì)胞的增多，逐漸分離，纖維組織漸減少、消失。二、AML及正常對(duì)照的RF含量變化：AML及正常對(duì)照的RF含量(見表1)均隨培養(yǎng)時(shí)程逐漸增加，AMLsm組18周RF含量均顯著低于正常對(duì)照組和AMLnsm組(P0.05)； 而AMLnsm組RF含量12周低于正常對(duì)照組(P0.05)， 而38周與正常對(duì)照組無明顯差異

13、（P0.05）。Groupn0123468(weeks)Control6031.674.4661.836.2174.3312.7992.0028.31137.0021.39135.5032.10AMLnsm7018.574.58*42.149.15*70.579.3180.1415.95125.1418.21113.8626.00AMLsm805.754.77*13.8810.75*26.5016.47*34.6319.91*50.5032.70*30.6316.89* *P0.05, vs control group;AML:actue myeloid leukemia; AMLnsm:no

14、 self-maintained;AMLsm:self-maintained 08 weeks:culture from the first to eight weeks 三、AML及正常對(duì)照的CF含量的變化：AML及正常對(duì)照組的CF含量(見表2)均隨培養(yǎng)逐漸增加，AMLsm組16周CF含量均顯著高于正常對(duì)照組和AMLnsm組(P0.05)，AMLnsm組與正常對(duì)照組18周均無明顯差別(P0.05)，第8周三組均無差別(P0.05)。Groupn0123468(weeks)Control6013.004.9442.6714.6857.007.6270.0011.3192.3322.2296.5

15、016.39AMLnsm7013.144.8133.8613.5151.2913.2670.2922.1289.7121.4193.1414.78AMLsm8021.636.02*92.8831.42*105.6329.87*134.0027.13*148.1329.78*79.5028.95 *P0.05, vs control group or AMLnsm group 四、觀察RF、CF與造血細(xì)胞分布的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：Masson染色下，CF(綠色)豐富的區(qū)域，造血細(xì)胞生長(zhǎng)密集(見1)，且可見造血細(xì)胞粘附甚至被包裹于CF中(見2)。Gomori染色下大量RF(黑色)存在的區(qū)域，造血細(xì)胞稀少，見

16、到的多為纖維細(xì)胞(見3)。在正常對(duì)照組、AMLnsm組和AMLsm組均觀察到上述類似現(xiàn)象，各組間無明顯不同。討論骨髓纖維組織主要包括RF和CF，由網(wǎng)狀細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成，它們是一種纖維蛋白的不同形態(tài)表現(xiàn)，均屬于膠原系統(tǒng)的物質(zhì)，RF即型膠原，形成的纖維較細(xì)；CF即型膠原，其外被蛋白質(zhì)和多糖的基質(zhì)粘聚成較粗的纖維5，7。雖然已發(fā)現(xiàn)惡性血液病骨髓纖維組織增生明顯1，2，其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)對(duì)AML患者骨髓細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AMLsm和AMLnsm兩個(gè)增殖不同的細(xì)胞群，它們的細(xì)胞外基質(zhì)RF、CF的含量和比例有明顯的差異，獲獨(dú)立生長(zhǎng)組的CF含量明顯高于正常對(duì)照和AMLnsm，而RF卻明顯低于正常

17、對(duì)照和AMLnsm，且CF多的區(qū)域有大量造血細(xì)胞生長(zhǎng)。提示纖維組織成分比例的改變可能影響造血細(xì)胞的增殖狀態(tài)，參與白血病的發(fā)生、發(fā)展。Basson等研究提出型膠原纖維能促使癌細(xì)胞增殖速度加快8。Fig 1 There are much collagen fibres(CF) (green) around the mass of hematopoietic cells by Massons staining (1010)1Masson染色下見造血細(xì)胞團(tuán)周圍有大量膠原纖維(1010倍)Fig 2 There are many hematopoietic cells adhered to CF (gr

18、een), or were encapsulated in CF by Massons staining (4010)2Masson染色下見造血細(xì)胞粘附甚被包裹于膠原纖維中(4010倍)Fig 3 There are few hematopoietic cells at the RF(black) area by Gomori staining (4010)3Gomori 染色下見大量網(wǎng)狀纖維(黑色)區(qū)域，造血細(xì)胞稀少(4010倍)另一結(jié)果發(fā)現(xiàn)LTBMC中貼壁層呈適當(dāng)融合（大部分融合）的AML易于獲獨(dú)立生長(zhǎng)。其可能原因：過量的纖維組織不利于造血的維持；一定量的纖維組織具有起支架、粘附造血因子作

19、用9，參與形成“龕”樣結(jié)構(gòu)，局部調(diào)控促進(jìn)造血；(3)白血病細(xì)胞可自分泌許多細(xì)胞因子，不僅促進(jìn)其自身生長(zhǎng)，尚可影響基質(zhì)細(xì)胞的合成和分泌功能，如成纖維細(xì)胞合成和分泌IL-1調(diào)節(jié)膠原酶和基質(zhì)溶解素的合成10，限制了貼壁層纖維組織的過渡增生。本實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果與張志宏等2林艷娟（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院， 福建省血液病研究所， 福建 福州 350001）呂聯(lián)煌（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院， 福建省血液病研究所， 福建 福州 350001）陳志哲（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院， 福建省血液病研究所， 福建 福州 350001）李覺民（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院， 福建省血液病研究所， 福建 福州 350001）張萍

20、容（福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院， 福建省血液病研究所， 福建 福州 350001）參考文獻(xiàn)1 夏利軍, 張春源, 翁維權(quán). 血液病患者骨髓纖維化觀察J. 中華血液學(xué)雜志，1990，11:355357.2張志宏, 范嘉璉, 石國英, 等. 血液病患者骨髓纖維組織和骨小梁變化的觀察J. 中華血液學(xué)雜志,1993, 14:468471.3Greenberger JS. Is the marrow stroma of AML patient a “l(fā)eukemic” stromaJ? Exp Hematol, 1992，20:10411042.4林艷娟, 呂聯(lián)煌, 陳志哲, 等. 急性髓系白血病細(xì)胞外基質(zhì)Fn, Lm的分析及臨床意義J. 中華血液學(xué)雜志, 1999, 20:3639.5凌啟波. 結(jié)締組織和肌纖維M. 見：凌啟波主編. 實(shí)用病理特殊染色和組化技術(shù).第1版. 廣州：廣東高等教育出版社，1989. 418.6浦權(quán).常用染色技術(shù)M. 見：浦權(quán)編著. 血液病骨髓組織病理學(xué)彩色譜. 第1版. 天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社, 1990. 1112.7Montes GS. Struc