大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備本方法適用于批量制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

1、氯化鈣法（ Calcium Chloride）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備本方法適用于批量制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，所得感受態(tài)細(xì)胞可以獲得 5 x 106 到 2x 107 轉(zhuǎn)化克隆 /微克超螺旋質(zhì)粒 DNA材料（ MATERIALS ）緩沖液和溶液（ Buffers and Solutions）（冰冷的） CaCl2?2H2O (1 M)冰冷的 MgCl 2-CaCl2 s 溶液 (solution, ice cold)培養(yǎng)基（ Media）用于初始培養(yǎng)物培養(yǎng)的LB 肉湯（ L-broth for initial growth of culture ）LB agar plates containi

2、ng appropriate antibiotic核酸（ Nucleic Acids ）質(zhì)粒 DNA（Plasmid DNA）或經(jīng)過重組的質(zhì)粒（ recombinant plasmid）方法1.從 37°C 過夜 (16-20 hours)培養(yǎng)平皿內(nèi)挑取一個直徑約為 2 到 3 毫米的單菌落。把這樣的單菌落接種于一只裝有 5 毫升 LB 肉湯的 30 毫升滅菌試管中，于 37°C 下振蕩培養(yǎng)過夜。 2. 轉(zhuǎn)移 0.2 毫升過夜培養(yǎng)物于一只裝有 15 或 20 毫升 LB 的 50 毫升滅菌三角瓶中 . 于 37°C 下振蕩培養(yǎng) 2 到 2.5 小時（此時細(xì)菌處于對

3、數(shù)生長期） 。 3. 室溫下， 4000 rpm 離心 5 分鐘收集對數(shù)期細(xì)胞。 棄培養(yǎng)基，保留細(xì)胞沉淀。5. 加入 10 毫升冰冷的 MgCl2-CaCl2 溶液，并輕微打勻。6. 4 C°下， 4000 rpm 離心 10 分鐘收集細(xì)胞。7. 棄 MgCl 2-CaCl2 溶液，保留細(xì)胞沉淀。8. 加入 0.8 毫升 (每 25 毫升初始培養(yǎng)物加入1 毫升 )冰冷的 0.1M 的 CaCl2 溶液，并輕微打勻。冰浴放置若干小時為最好。9. 此時的感受態(tài)細(xì)胞可以依照下面的步驟 10 到 16 直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，也可以分裝 ,加入甘油后于 -70 °C 冰凍保藏。10. 向

4、事先滅菌，并經(jīng)冷處理的 1.5ml 聚丙烯管中轉(zhuǎn)移 100 微升感受態(tài)細(xì)胞懸浮液。向每個轉(zhuǎn)化管中加入 DNA( 一般含量是 10 微升或更低的體積中所含量應(yīng)不超過 50 納克 )。細(xì)心混勻管中成份。于冰浴放置30 到 40 分鐘。11. 把轉(zhuǎn)化管轉(zhuǎn)移至放于42°C 循環(huán)水浴鍋中預(yù)熱的試管架上，準(zhǔn)確計(jì)時90 秒。（此時不能搖動轉(zhuǎn)化管）12. 把試管迅速轉(zhuǎn)移至冰浴 2 到 3 分鐘。13. 向每只試管中加入 500 微升 LB 肉湯。37°C 放置 45 到 90 分鐘，以使細(xì)菌復(fù)原，并容許質(zhì)粒所編碼的抗生素抗性的表達(dá)。14. 轉(zhuǎn)移適量體積（如果使用 90 毫米平板，一半涂布量

5、不應(yīng)超過 100 微升）的經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的感受態(tài)細(xì)胞涂布于含有 相應(yīng)抗生素的 LB- 瓊脂平板上。15. 室溫放置平板直到其上液體被吸收。16. 于 37°C 倒置平板培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化克隆應(yīng)該于12-16 小時區(qū)間出現(xiàn)。感受態(tài)原理：在自然條件下 ,很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi) ,但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中 ,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的 mob 基因 ,因此不能自行完成從一個細(xì)胞到另一個細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA 。轉(zhuǎn)化 (Transformation)是將外源 DNA 分子引入受體細(xì)胞 ,使之獲得新的遺傳性狀的

6、一種手段 ,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株， 即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體 (R,M它),可以容忍外源 DNA 分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法 ( 如電擊法 ,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法 )的處理后 ,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源 DNA 分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞 (Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA 分子通過復(fù)制 ,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移 ,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 即可篩選出轉(zhuǎn)化

7、子 (Transformant,即帶有異源DNA 分子的受體細(xì)胞 )。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl) 法， RbCl(KCl) 法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高 ,但 CaCl2 法簡便易行 ,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求 ,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時 ,可加入占總體積 15的無菌甘油于 -70保存 (半年 ),因此 CaCl2 法為使用更廣泛。為了提高轉(zhuǎn)化效率 , 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個重要因素：1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度 : 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于的培養(yǎng)菌， 最好從 70或 -20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛

8、進(jìn)入對數(shù)生長期時為好， 可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的 OD600 來控制。 DH5 菌株的 OD600 為 0.5 時,細(xì)胞密度在 5×107 個/ml 左右 ( 不同的菌株情況有所不同 ),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度 : 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 應(yīng)主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA) 。轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度在一定范圍內(nèi)成正比 ,但當(dāng)加入的外源 DNA 的量過多或體積過大時 ,轉(zhuǎn)化效率就會降低。 1ng 的 cccDNA 即可使 50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。 一般情況下 ,DNA 溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的 5。3. 試劑的質(zhì)量

9、: 所用的試劑 ,如 CaCl2 等均需是最高純度的 (GR.或 AR.),并用超純水配制 ,最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜 DNA 的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行 , 所用器皿 , 如離心管 , tip 頭等最好是新的 ,并經(jīng)高壓滅菌處理 ,所有的試劑都要滅菌 ,且注意防止被其它試劑、 DNA 酶或雜 DNA 所污染 , 否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA 的轉(zhuǎn)入 , 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。本實(shí)驗(yàn)以 E.coli DH5a 菌株為受體細(xì)胞 ,并用 CaCl2 處理 ,使其處于感受態(tài) ,然后與pBS 質(zhì)粒共保溫 ,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS 質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗

10、性基因(Ampr ) ，可通過 Amp 抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp 的培養(yǎng)基上不能生長。能在 Amp 培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了 pBS。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。本實(shí)驗(yàn)以 E.coli DH5a 菌株為受體細(xì)胞 ,并用 CaCl2 處理 ,使其處于感受態(tài) ,然后與pBS 質(zhì)粒共保溫 ,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pBS 質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr ) ，可通過 Amp 抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS，則在含Amp 的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp 培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了 pBS。

11、轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。第二節(jié)材料、設(shè)備及試劑一. 材料E. coli DH5 菌株 : R,M,Amp；pBS 質(zhì)粒 DNA:購買或?qū)嶒?yàn)室自制，eppendorf 管。二. 設(shè)備恒溫?fù)u床 ,電熱恒溫培養(yǎng)箱 ,臺式高速離心機(jī) ,無菌工作臺 ,低溫冰箱 , 恒溫水浴鍋 , 制冰機(jī) , 分光光度計(jì) ,微量移液槍。三. 試劑1.LB 固體和液體培養(yǎng)基：配方見第一章。2.Amp 母液：配方見第一章。3.含 Amp 的 LB 固體培養(yǎng)基 :將配好的 LB 固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至60左右 ,加入 Amp 儲存液 ,使終濃度為 50ug/ml,搖勻后鋪板。4.麥康

12、凱培養(yǎng)基 (Maconkey Agar):取 52g 麥康凱瓊脂 ,加蒸餾水 1000ml,微火煮沸至完全溶解 ,高壓滅菌，待冷至 60左右加入 Amp 儲存液使終濃度為50ug/ml,然后搖勻后涂板。5.0.05mol/L CaCl2 溶液 :稱取 0.28g CaCl2(無水 ,分析純 ),溶于 50ml 重蒸水中 ,定容至 100ml,高壓滅菌。6.含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl2: 稱取 0.28g CaCl2(無水 ,分析純 ),溶于 50ml 重蒸水中 ,加入 15ml 甘油 ,定容至 100ml,高壓滅菌。第三節(jié)操作步驟一、 受體菌的培養(yǎng)從 LB 平板上挑取新活化

13、的 E. coli DH5 單菌落 ,接種于 3-5ml LB 液體培養(yǎng)基中 ,37下振蕩培養(yǎng) 12 小時左右 , 直至對數(shù)生長后期。將該菌懸液以1:100-1:50 的比例接種于100ml LB 液體培養(yǎng)基中 ,37振蕩培養(yǎng)2-3 小時至OD600 0.5 左右。二、 感受態(tài)細(xì)胞的制備( CaCl2 法)1、將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中,冰上放置 10 分鐘 ,然后于 4下 3000g 離心 10分鐘。2、 棄去上清 ,用預(yù)冷的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 10ml 輕輕懸浮細(xì)胞 ,冰上放置 15-30 分鐘后 ,4下 3000g 離心 10 分鐘。3、棄去上清 ,加入 4ml 預(yù)冷含

14、 15%甘油的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 ,輕輕懸浮細(xì)胞 ,冰上放置幾分鐘 ,即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。4、 感受態(tài)細(xì)胞分裝成200l的小份 ,貯存于 -70可保存半年。三、 轉(zhuǎn)化1、從 -70冰箱中取 200l感受態(tài)細(xì)胞懸液 ,室溫下使其解凍 ,解凍后立即置冰上。2、 加入 pBS 質(zhì)粒 DNA 溶液 (含量不超過 50ng,體積不超過 10l),輕輕搖勻 ,冰上放置 30 分鐘后。3、42水浴中熱擊 90 秒或 37水浴 5 分鐘 ,熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘。4、向管中加入 1ml LB 液體培養(yǎng)基 (不含 Amp),混勻后 37振蕩培養(yǎng) 1 小時 ,使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀

15、態(tài) ,并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因 (Ampr ) 。5、將上述菌液搖勻后取100l 涂布于含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿,37培養(yǎng)16-24 小時。同時做兩個對照 :對照組 1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA 溶液 ,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB 平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。對照組 2: 以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液 ,但涂板時只取 5l 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。四、 計(jì)算轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子， 根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù) ×稀釋倍數(shù) ×轉(zhuǎn)化反應(yīng)