赤子愛(ài)勝蚓五種纖溶酶組分的分離純化及對(duì)纖維蛋白原酶解的初步研究

1、    赤子愛(ài)勝蚓五種纖溶酶組分的分離純化及對(duì)纖維蛋白原酶解的初步研究        提要經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀和PAGE制備電泳，從赤子愛(ài)勝蚓(Eisenia foelide)粗品中分離純化出五種纖溶酶組份(、)，在PAGE中均呈現(xiàn)單一帶。組份、能將纖維蛋白原中、鏈依次降解，對(duì)鏈親和力最大。組份X不能降解43.5KD、40KD、24.5KD片段。組份對(duì)鏈有較高親和力而對(duì)鏈無(wú)降解作用。 關(guān)鍵詞赤子愛(ài)勝蚓蚯蚓纖溶酶純化酶解纖維蛋白原降解血管栓塞是一類(lèi)對(duì)人類(lèi)危害極大的疾病?，F(xiàn)有治療藥物

2、，由于其副作用，使用受到一定程度的限制。從自然界中尋找安全、有效、方便的溶血栓藥物當(dāng)是一條很好途徑。蚯蚓俗稱(chēng)地龍，作為藥用，在中國(guó)已有幾千年的歷史，具清熱、通絡(luò)、平喘、利尿、化瘀等功效。1983年，日本學(xué)者M(jìn)ihara等首次發(fā)表了從蚯蚓中提取纖溶酶并試用于臨床的報(bào)道，隨后國(guó)內(nèi)外也有一些單一組份蚯蚓纖溶酶純化以及臨床應(yīng)用的報(bào)道13。但對(duì)蚯蚓纖溶酶多組份的分離純化及各組份對(duì)纖維蛋白原的酶解作用尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)此作了初步研究。1實(shí)驗(yàn)部分1.1材料與儀器赤子愛(ài)勝蚓粗品(自制)；牛血纖維蛋白原、人血纖溶酶原、凝血酶、尿激酶(中國(guó)藥品生物制品檢定所)；Acr、Bis、TEMED、考馬斯亮藍(lán)R-250、G-2

3、50(Fluka公司)；瓊脂糖(BDH進(jìn)口分裝)。DY-600型中壓電泳儀(汕頭廣播儀器廠)；CDS-200型薄層掃描儀(Beckman公司)；FM-SFF-QD型冷凍干燥器(Snijders公司)。1.2方法PAGE蛋白質(zhì)條帶快速染色在Diezel等人3方法的基礎(chǔ)上作了改進(jìn)，染色液為0.05%(W/V)考馬斯亮藍(lán)G-250水溶液(含3.5%高氯酸)，PAGE凝膠條帶浸于染色液中，100水浴染色1min，不脫色。纖溶酶活性在Deogny4方法基礎(chǔ)上有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)含量采用Lowry6法，以結(jié)晶牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。純度測(cè)定采用PAGE法5；分子量測(cè)定采用SDS-PAGE法5。分離純化采用70%飽

4、和度硫酸銨鹽析及在Davis7方法上改進(jìn)的不連續(xù)PAGE垂直平板法制備電泳。蚯蚓纖溶酶粗品溶于0.1mol/L NaCl中(110)，室溫浸泡過(guò)夜，離心，清液加固體硫酸銨至70%飽和度，4過(guò)夜，離心，沉淀溶于水經(jīng)透析除鹽，冷凍干燥得纖溶酶初步純化品。將此初步純化品用電極緩沖液溶解(2mg/ml)，并加蔗糖達(dá)20%濃度，進(jìn)行第一次PAGE平板制備電泳，上樣1520mg。電泳結(jié)束后，切下左右各1cm寬凝膠條，以快速染色法檢出蛋白質(zhì)條帶，以此作對(duì)照，切下未染色凝膠中相應(yīng)蛋白質(zhì)條帶，在4，0.15mol/L NaCl中浸泡過(guò)夜，超濾膜過(guò)濾。同法提取3次，合并3次提取液，透析除鹽，凍干，再進(jìn)行第二次制備

5、電泳，得蚯蚓纖溶酶純品。2結(jié)果與討論2.1蚯蚓纖溶酶粗品中活性組份的數(shù)目粗品組份數(shù)目經(jīng)PAGE分離，纖溶酶粗品包括十三種不同的組份(1)。Fig 1Pattern of PAGE (left to right 1 2 3 4 5 6 7 8)1 2 3 Crude EFE4 56 7 8粗品組份的百分含量粗品經(jīng)PAGE分離后，凝膠用薄層掃描儀分析各峰面積，自動(dòng)積分打印出各組份的百分含量。含量占10%以上的組份有、，組份、的百分含量見(jiàn)表1。粗品活性組份以纖維平板法測(cè)定各組份的纖溶活性及比活性?；钚越M份有、九種，純化分離七種，其中五種比活性見(jiàn)表1。Table 1Percentage and sep

6、ecific activity of EFEsComponentSepecific activity(mm2/mg)Percentage883110.6284677.2175247.2190365.8100054.6Crude EFE4955綜合分析，纖溶酶粗品中含十三種組份，其活性組份九種，與文獻(xiàn)1報(bào)道相同?；钚越M份含量占總量的66.8%，溶解纖維蛋白效果明顯，粗品比活為4955mm2/mg，而純化組份比活性高達(dá)28467mm2/mg。2.2蚯蚓纖溶酶的分離純化2.2.1初步純化赤子愛(ài)勝蚓粗品經(jīng)硫酸銨鹽析得蚯蚓纖溶酶的初步純化品。2.2.2半成品制備經(jīng)第一次PAGE電泳得到半成品，含所要分離

7、組份及少量鄰帶組份。2.2.3純品制備半成品經(jīng)第二次制備電泳得純品，經(jīng)PAGE檢查為一條帶，共分離純化了、七種活性組份(1)。并對(duì)、五種組份進(jìn)行了較多量制備。2.2.4純度鑒定上述五種組份經(jīng)PAGE、SDS-PAGE和等電聚焦電泳作純度檢測(cè)，均顯示單一條帶。2.2.5比活力測(cè)定酶溶液蛋白質(zhì)含量以Lowry法測(cè)定6。以纖維平板法測(cè)定各組份的纖溶活性。各組份比活力見(jiàn)表1。結(jié)果表明，該分離純化方法與文獻(xiàn)1報(bào)道的纖溶酶分離純化方法相比，有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。能將樣品中分子量相差很小，電荷差異不大的幾種組份分開(kāi)；純化程度高；樣品分離純化周期短；能夠分離含量極少的樣品。2.3五種純化組份對(duì)纖維蛋白原酶解的動(dòng)態(tài)觀

8、察2.3.1反應(yīng)條件40l酶液(1.2g/ml)與1ml纖維蛋白原(2mg/ml)混合，37保溫，分別于1、15、30、45、60、120min取出一定量反應(yīng)液，中止其反應(yīng)，然后用SDS-PAGE垂直平板法觀察五種纖溶酶組份對(duì)纖維蛋白原在不同時(shí)間的降解情況。標(biāo)準(zhǔn)纖維蛋白原經(jīng)SDS-PAGE電泳后，分為三個(gè)區(qū)帶，從上至下分別命名為、鏈(2)。 Fig 2Pattern of SDS-PAGE of hydrolying frament of Fibrinogen by purified fibrinolytic enzymes (left to right 1 2 3 4 5 6 7 8, up

9、 to down 94、67、43、30、17.5 KD A=component I B=component C=component D=component E=comporent X)1 Fibrinogen2 1min3 13min4 30min5 45min6 60min7 120min8 marker2.3.2.相似點(diǎn)由電泳譜和片段大小分析，組份、作用相似點(diǎn)有鏈15min內(nèi)基本被降解，產(chǎn)物約為34KD和31KD，兩片段可隨時(shí)間延長(zhǎng)而進(jìn)一步降解；鏈30min內(nèi)被降解，可能生成435、40、30、24.5KD片段，這幾個(gè)片段可能被繼續(xù)降解生成27、26KD和13KD片段；鏈30min后逐步

10、降解，至2h基本完成，可能生成42.5、39、27.5 KD片段。2.3.3特異點(diǎn)X不能降解鏈的降解產(chǎn)物43.5、40、24.5KD三種片段；X和降解生成的13KD，不能繼續(xù)被降解；、組份降解活性大于、，15min內(nèi)、鏈均被降解；和對(duì)31KD和30KD的降解活性大于和。組份與上述四種組份對(duì)纖維蛋白原的作用有較大差別。鏈30min內(nèi)完全降解，且不對(duì)34KD和31KD繼續(xù)降解；對(duì)鏈降解很弱，生成27KD，對(duì)鏈2h內(nèi)不降解。上述結(jié)果初步表明，五種組份對(duì)纖維蛋白原、鏈既有相同的作用位點(diǎn)，也有不同的作用位點(diǎn)，對(duì)、鏈的親和力不同，對(duì)鏈親和力最大，鏈次之，對(duì)鏈親和力最小。對(duì)纖維蛋白原降解產(chǎn)物，各組份具有不同

11、的降解能力。五種纖溶酶組份對(duì)纖維蛋白原的降解作用速度均有差異，其中、降解作用最強(qiáng)，、次之，降解作用最慢，主要作用于鏈，對(duì)鏈作用很弱，對(duì)鏈不作用。鮑錦庫(kù)四川大學(xué)生物化學(xué)教研室作者單位：彭先鳳楊繼虞陶建寧彭余田鮑錦庫(kù)華西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院成都 610041參考文獻(xiàn)1彭先鳳，曾蕾，陳麗波等.藥用蚯蚓纖溶酶的制備及其性質(zhì)的研究.華西藥學(xué)雜志，1998，13(1)192Hiroyuki S, Nobuyoshi N, Hisashi M. A very stable and Potent fibrinolytic enzyme found in Earthworm Lumbricus Rubellus Au

12、tolysate. Comp Biochem, Physical. 1993,106B(3)7633Diezel W,Kopperschlger G, Hofmarm E.An improved procedure for potein staining in polyacylanide gels with a new type of coomassie trilliant blue. Anal Biochem, 1972，486174Deoguy L.Improved fibrin plate method for fibrinolytic activity measurements.Clinca Chemica Acta,1975,60855張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實(shí)