熒光與亞甲藍(lán)聯(lián)用對(duì)血漿中病毒滅活的研究

1、    熒光與亞甲藍(lán)聯(lián)用對(duì)血漿中病毒滅活的研究黃宇聞程慶文莫琴謝如鋒錢開誠(chéng) 提要以細(xì)胞感染試驗(yàn)、凝血法、交叉免疫電泳等技術(shù)，觀察熒光與亞甲藍(lán)聯(lián)用對(duì)血漿中水泡性口炎病毒（VSV）和辛德比斯病毒（SV）的滅活效果及血漿蛋白的變化。結(jié)果，向盛裝在聚氯乙烯袋內(nèi)的血漿中加1 mol/L亞甲藍(lán)并經(jīng)熒光(30 000 Lux)照射30 min，可將血漿中滴度>7 TCID50(lg)的VSV和SV滅活。消毒后，血漿中的:C、:C、纖維蛋白原的回收率>75，白蛋白、球蛋白的回收率>85，蛋白免疫原性無變化。 關(guān)鍵詞協(xié)同滅活病毒作用熒光亞甲藍(lán)血漿消毒水泡

2、性口炎病毒辛德比斯病毒 STUDY ON INACTIVATION OF VIRUS IN PLASMA BY COMBINATION OF FLUORESCENCE AND METHYLENE BLUE Huang YuwenCheng QingwenMo QinXie RufengQian Kaicheng (Shanghai Blood Center, Shanghai 200051) AbstractTechniques such as cell infection test, blood coagulation method and crossed immunoelectrophor

3、esis were used to observed the efficacy of combination of fluorescence and methylene blue in inactivating vesicular stomatitis virus (VSV) and Sindbis Virus in plasma and the changes in plasma protein. The results showed that addition of 1 mol/L methylene blue to the plasma in polyvinyl chloride bag

4、 which was also exposed to fluorescence (30000 Lux) irradiation for 30 min could inactivate VSV and SV with titers >7 TCID50 (lg) in plasma. After disinfection, the recovery rates of F:C， F:C and fibrinogen were >75% and the recovery rates of albumin, globulin (IgG, IgA, IgM) were >85%, whi

5、le no change in protein immunogenicity was observed. Key wordssynergetic inactivating effect on virusfluorescencemethylene blueplasma disinfectionvesicular stomatitis virusSindbis virus 為防輸注血漿引起感染乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等的危險(xiǎn)，已研究出多種對(duì)血漿中病毒滅活的方法，如加熱法、有機(jī)溶劑加表面活性劑（S/D）法、乙型丙內(nèi)酯加長(zhǎng)波紫外線法等1。對(duì)臨床用單袋血漿中病毒的滅活，上述方法均不適宜，而

6、宜采用亞甲藍(lán)加可見光照射法2。我們將染以指標(biāo)病毒的血漿盛裝于聚氯乙烯（PVC）袋內(nèi)，向血漿中加亞甲藍(lán)后經(jīng)不同光源照射，觀察病毒滅活效果及其對(duì)血漿蛋白質(zhì)的影響。發(fā)現(xiàn)以熒光光源照射者對(duì)病毒滅活效果較好，血漿內(nèi)各種蛋白損失較小。為此，對(duì)亞甲藍(lán)加熒光照射法進(jìn)行了較詳細(xì)地研究?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道于下。 1 方法 1.1 試驗(yàn)病毒 試驗(yàn)用水泡性口炎病毒（VSV，Indiana株）和辛德比斯病毒（SV，與VSV均由中國(guó)藥品衛(wèi)生制品鑒定所提供），分別以非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、BHK細(xì)胞為宿主傳3代。收集上清液，測(cè)得病毒滴度>7 lgTCID50/ml，分裝于無菌塑料試管中，置- 80保存，備用。 1.2

7、含病毒血漿的制備及滅活試驗(yàn) 隨機(jī)取采血后6 h內(nèi)分離冰凍的ACD (acid-citrate-dextrose)抗凝血漿（盛裝于PVC塑料袋內(nèi)，100 ml/袋），于37融化后，按血漿病毒液91的容量比接種病毒，混勻。 試驗(yàn)時(shí)，取該血漿1 ml作為消毒前對(duì)照，取該血漿99 ml加入100 mol/L的注射用亞甲藍(lán)1 ml（血漿中亞甲藍(lán)濃度為1 mol/L），隨即用熒光（30 000 Lux）照射30 min。 1.3 病毒的滴定 病毒滴定均按終點(diǎn)稀釋法，在96孔板上進(jìn)行。樣本經(jīng)10倍梯度稀釋，每一稀釋度接種46孔。同時(shí)設(shè)有細(xì)胞對(duì)照，并盲傳三代。據(jù)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），按Karber公式計(jì)算T

8、CID50。 lg TCID50=l-d(s-0.5) 式中，l為病毒最高稀釋度的對(duì)數(shù)，d為稀釋度對(duì)數(shù)間差數(shù)，s為病變細(xì)胞比例總和。 1.4 血漿蛋白的測(cè)定 F:C及F:C活性的測(cè)定按一期法3進(jìn)行，纖維蛋白原含量測(cè)定采用凝血法。蛋白質(zhì)含量（包括白蛋白和球蛋白）用比濁法測(cè)定。以交叉免疫電泳法測(cè)定消毒前后血漿蛋白質(zhì)免疫原性變化。 1.5 動(dòng)物安全試驗(yàn) 取約3 kg體重健康家兔6只。試驗(yàn)前，置于固定器中停止給食2 h。然后，從耳靜脈抽血（抽血量為6.5 ml/kg體重）。分離血漿，加入亞甲藍(lán)至試驗(yàn)濃度并經(jīng)熒光照射30 min后，-20凍存。一周后，將該血漿對(duì)家兔作自身回輸，觀察體重與體癥狀況。 2

9、結(jié)果 2.1 滅活病毒效果 在血漿中加1 mol/L亞甲藍(lán)經(jīng)熒光（30 000 Lux）照射30 min，可使血漿中滴度>7 TCID50(lg)的VSV和SV達(dá)到滅活（表1）。單對(duì)血漿中VSV，只要加0.10 mol/L亞甲藍(lán)經(jīng)熒光照射30 min，即可滅活（表2）。細(xì)胞對(duì)照盲傳3代均未見崐特異CPE。 表1 亞甲藍(lán)加熒光照射對(duì)血漿中病毒的滅活效果 Table 1 Efficacy of methylene blue plus fluo- rescence irradiation in inactivating virus in plasma 處理時(shí)間 VSV滴度 SV滴度 Expos

10、ure VSV SV time titer titer (min) (lg,TCID50) (lg,TCID50) 15 < 0.50* 1.09 30 < 0.50 < 0.50 >>> 注:* 表示所用方法已測(cè)不到病毒滴度。對(duì)照病毒滴度VSV為7.5 TCID50(lg)，SV為7.28 TCID50(lg)。血漿中亞甲藍(lán)濃度為1 mol/L。Note: * means that the virus titer was not detected by the method used. The titer of control virus was 7.5

11、TCID50 (lg) for VSV and 7.28 TCID50 (lg) for SV. The concentration of methylene blue in plasma was 1 mol/L. 表2 不同濃度亞甲藍(lán)加熒光照射對(duì)血漿中VSV的 滅活效果 Table 2 Efficacy of methylene blue at different con- centrations plus fluorescence irradiation in inactivating VSV in plasma 亞甲藍(lán)濃度 Concentra- tion of methylene blu

12、e (molL) 照射不同時(shí)間(min)的 VSV滴度 (lg, TCID50) VSV titer (lg, TCID50) after irradiation for different periods of time (min) 15 30 0.80 < 0.50* < 0.50 0.40 < 0.50 < 0.50 0.20 < 0.50 < 0.50 0.15 2.50 < 0.50 0.10 2.50 < 0.50 注:*表示所用方法已測(cè)不到病毒滴度。對(duì)照病毒滴度為7.5 TCID50(lg)。Note: * means that t

13、he virus titer was not detected by the method used. The titer of control virus was 7.5 TCID50 (lg). 2.2 對(duì)部分凝血因子活性的影響 加1 mol/L亞甲藍(lán)后經(jīng)熒光（30 000 Lux）照射30 min，血漿中F :C及F:C、纖維蛋白原（Fir）的回收率均仍達(dá)75以上（圖1）。 圖1 亞甲藍(lán)加熒光照射對(duì)部分凝血因子的影響 Fig 1 Influence of methylene blue plus fluorescence irradiation on some coagulation fa

14、ctors - F :C，-F :C，-Fir (fibrinogen) 2.3 對(duì)蛋白質(zhì)含量及其免疫原性的影響 加1 mol/L亞甲藍(lán)后經(jīng)熒光（30 000 Lux）照射30 min, 血漿白蛋白、球蛋白的回收率均仍高于85（表3）。 表3 亞甲藍(lán)加熒光照射對(duì)血漿蛋白質(zhì)含量的影響 Table 3 Influence of methylene blue plus fluores- cence irradiation on plasma protein content 蛋白質(zhì)Protein Recovery rate (%) after 作用30 min后的回收率(%) exposure for

15、 30 min 白蛋白 Albumin 93.13±9.20 IgG 87.79±10.54 IgA 89.99±9.46 IgM 86.95±10.37 注:血漿中亞甲藍(lán)濃度為1 mol/L。熒光照射前白蛋白、球蛋白回收率均為100。數(shù)據(jù)為檢測(cè)10份樣本的結(jié)果。Note: Methylene blue concentration in plasma was 1 mol/L. Recovery rate of albumin and globulin before fluorescence irradiation was 100%. The result

16、s are means of 10 samples.于消毒前后以交叉免疫電泳法測(cè)血漿蛋白免疫原性沒有變化，各沉淀線位置一致（圖2）。 2.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)表明，將加濃度為1 mol/L或10 mol/L亞甲藍(lán)并經(jīng)熒光（30 000 Lux）照射30 min的兔血漿，回輸給原采血兔。7天內(nèi)，該兔體重變化和毛色均與對(duì)照組兔子一致。 3 討論 3.1 據(jù)報(bào)道，亞甲藍(lán)加可見光照射可以滅活大多數(shù)有脂質(zhì)包膜的RNA和DNA病毒。亞甲藍(lán)與病毒核酸的鳥嘌呤結(jié)合，在可見光的作用下，使病毒核酸斷裂，阻止其復(fù)制。此外，在有氧條件下還可產(chǎn)生氧自由基，對(duì)脂質(zhì)包膜病毒的膜蛋白和核酸鏈也有破壞作用2,4。滅活病毒的效

17、果與亞甲藍(lán)濃度和光照強(qiáng) 度有關(guān)4。我們以亞甲藍(lán)加熒光照射亦能滅活血漿中VSV和SV，滅活所需時(shí)間隨血漿中亞甲藍(lán)濃度升高而縮短。 圖2 亞甲藍(lán)加熒光消毒前后的血漿蛋白免疫性 Fig 2 Plasma protein immunogenicity before and after disinfection by methylene blue plus fluorescence irradiation 3.2 在新鮮冰凍血漿所含的諸成分中，以不穩(wěn)定的凝血因子對(duì)理化作用較為敏感。研究者多以:C、:C及纖維蛋白原的回收率作為衡量理化作用對(duì)血漿有效成分影響的指標(biāo)5,6。本試驗(yàn)表明，經(jīng)1 mol/L亞甲藍(lán)加

18、熒光（30 000 Lux）照射30 min后，血漿纖維蛋白原、:C和:C等凝血因子回收率均>75，即無明顯不良影響。同時(shí)，血漿中主要蛋白質(zhì)，如白蛋白、球蛋白（IgG、IgA、IgM）回收率亦均在85以上；血漿蛋白質(zhì)免疫原性亦沒有變化。亞甲藍(lán)作為治療用藥，臨床較低劑量為266 mol/50 kg。本研究所用量（1 mol/L）以2 L/50 kg體重輸注計(jì)，輸注量尚不足其1，故是安全的。將兔子血漿用亞甲藍(lán)加熒光照射后回輸，亦表明對(duì)動(dòng)物無毒副作用。 本課題研究過程中承蒙上海市血液中心張欽輝教授、高峰教授的指導(dǎo)，并得到上海市血液中心鑒定室動(dòng)物房陳桂珍老師的幫助，特此致謝。 黃宇聞（上海市血液中心，上海200051） 程慶文（上海市血液中心，上海200051） 莫琴（上海市血液中心，上海200051） 謝如鋒（上海市血液中心，上海200051） 錢開誠(chéng)（上海市血液中心，上海200051） 參考文獻(xiàn) 1Ben-Hur E, Horowitz B. Virus inactivation in blood. AIDS, 1996; 10:1183. 2Lambreoht B, Mohr H, Knuver-Hopf J, et al. Photoinactivation of viruses in human fresh plasma