血管平滑肌細胞快速牽張損傷后細胞縫隙連接功能的變化

1、血管平滑肌細胞快速牽張損傷后細胞縫隙連接功能的變化                作者：徐錫金，霍霞，李燕，Margaret A  摘要目的：探討牽張損傷時血管平滑肌細胞(A7r5)縫隙連接功能的改變及其影響因素。方法：采用細胞牽張損傷裝置建立A7r5細胞損傷模型，通過細胞培養(yǎng)、熒光顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡熒光漂白后恢復(fù)技術(shù)檢測對照組，輕度、中度和重度牽張損傷組細胞活性(Hoechst 33342和propidium iodide染色)、細胞

2、內(nèi)鈣(Fluo_4/AM染色)、細胞內(nèi)氧自由基(H2DCFDA染色)和細胞間通訊功能(5_CFDA染色)的變化。結(jié)果：隨著細胞牽張損傷的加重，細胞活性降低、細胞內(nèi)鈣及細胞內(nèi)氧自由基升高、細胞間通訊功能下調(diào)。含鈣緩沖液和細胞間通道阻斷劑甘珀酸可使細胞通訊功能進一步下調(diào)，而Ca2鰲合劑乙二醇四乙酸、氧自由基清除劑超氧化物歧化酶可使細胞通訊功能上調(diào)。結(jié)論：牽張損傷可通過細胞內(nèi)鈣超載和活性氧的增多來降低平滑肌細胞縫隙連接的細胞通訊功能。 關(guān)鍵詞平滑肌細胞(A7r5)；細胞損傷；縫隙連接AbstractObjective: To estimate the role and affected mechan

3、ism of gap junctions during cell injury. Methods: A7r5 cells were seeded onto six_well FlexPlates that had a silastic bottom and provided the ability to deform and injure the cells. Mild, moderate and severe groups of rapid stretch injury(RSI, 55, 65, 75 mm deformation)were produced u_sing a model 9

4、4A cell injury controller. Cell injury was defined as the percent of Hoechst 33343 stained cells that stained with propidium iodide(PI). Gap junction communication was assayed using fluorescence recovery after photobleaching(FRAP). Cells were loaded with 5_carboxyfluorescein diacetate and intracellu

5、lar fluorescence was measured using confocal laser scanning microscopy(CLSM). FRAP was expressed as percent of baseline fluorescence. Intracellular Ca2+(Ca2i)and reactive oxygen species(ROS)were imaged under CLSM using the fluorescent dyes fluo_4 AM and H2DCFDA/AM, respectively. Results: RSI produce

6、d level dependent increased in PI_positive cells, Ca2i and ROS, but decreased in gap junctional communication. DPBS with calcium and gap junction blocker Carbenoxalone could further decrease gap junction communication; whereas antioxidant SOD or the calcium chelator EGTA could increase gap junction

7、communication. Conclusion: These results suggest that increases in Ca2i and ROS contribute to cell injury and impaired gap junctional communication after RSI in A7r5 cells in vitro.Key WordsA7r5 Cell; cell injury; gap junction創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是臨床上最常見的腦損傷之一。嚴重的TBI后，繼發(fā)性腦損傷可導(dǎo)致不良后果。繼發(fā)性腦損傷通常都認為是缺血引起的，主要與損傷后的低血

8、壓、低氧血癥和顱內(nèi)壓增高有關(guān)。可能的機制包括腦血管痙攣和血循環(huán)壓力自主調(diào)節(jié)機制受損?？p隙連接的細胞通訊功能是細胞維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的最重要功能之一。血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的縫隙連接被認為參與血管收縮和舒張，甚至參與腦血管自主調(diào)節(jié)機制1,2。本實驗利用體外培養(yǎng)血管平滑肌細胞的牽張損傷模型3，模擬在體腦創(chuàng)傷過程中細胞受壓、牽張變形的應(yīng)力變化，研究體外培養(yǎng)血管平滑肌細胞在不同程度牽張損傷后縫隙連接功能的變化及其影響因素和意義。1  材料與方法11  細胞培養(yǎng)A7r5細胞(American Type Culture Collection，美國)培養(yǎng)于6孔硅膠膜培養(yǎng)板(Flexcel

9、l公司，美國)，每孔細胞濃度為2×105/mL，用DMEM(Cellgro公司，美國)和體積分數(shù)10%胎牛血清(Gibco公司，美國)，并常規(guī)加入青霉素(100ku/L)和鏈霉素(100mg/L)，在37、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞處于單層融合狀態(tài)。12  細胞牽張損傷模型的建立根據(jù)文獻3的方法，將硅膠膜培養(yǎng)板與牽張細胞損傷裝置(94A Cell Injury Controller，美國)相連并保持密封。選擇3個水平脈沖壓力(55，66和75mm變形)損傷細胞，分別定為輕度、中度、重度細胞損傷組，同時設(shè)立對照組。13  細胞活力檢測牽張損傷后A7r5細

10、胞隨即用碘化丙碇PI，Sigma公司，美國和Hoechst 33342(Sigma公司，美國)各5g/mL在培養(yǎng)箱中共同染色30min4。熒光顯微鏡(Nikon公司，日本)觀察，在每個細胞培養(yǎng)孔中隨機選擇5個視野(中、上、下、左、右)，每個視野計數(shù)100個細胞中PI陽性細胞數(shù)，取均值，以百分數(shù)值表示。PI陽性細胞即損傷細胞呈紅色，其他細胞呈藍色。14  細胞通訊功能檢測采用熒光漂白后恢復(fù)(FRAP)技術(shù)進行細胞間通訊功能的檢測5。細胞用5，6_CFDA/AM(Molecular Probes公司，美國)5g/mL，37染色30min。用LSM510共聚焦激光掃描顯微鏡(Zeiss公司

11、,德國)時間序列掃描方式進行掃描程序編輯，每隔20s掃描1次細胞，連續(xù)掃描10min。選擇熒光強度適中并與周圍有多個相鄰細胞的細胞為淬滅對象，用強激光將被選定的細胞內(nèi)的熒光淬滅，再用弱激光掃描細胞，觀察細胞內(nèi)熒光恢復(fù)程度。通過該儀器的軟件獲取圖像與數(shù)據(jù)，以熒光恢復(fù)率判斷細胞通訊功能。為判斷細胞內(nèi)鈣(Ca2i)和細胞內(nèi)活性氧(ROS)與細胞通訊功能的關(guān)系，還分別使用含鈣緩沖液(DPBS，Cellgro公司，美國)、細胞通道阻斷劑甘珀酸(CBX，Sigma公司，美國)5mmol、Ca2+鰲合劑乙二醇四乙酸(EGTA，Molecular Probes公司，美國)5g/mL、氧自由基清除劑超氧化物歧化

12、酶(SOD，Sigma公司，美國)25g/mL處理各組細胞。15  細胞內(nèi)鈣檢測細胞用fluo_4/AM(Molecular Probes公司，美國)10g/mL，37染色30min，LSM510共聚焦激光掃描顯微鏡檢測，用Metamorph圖像分析軟件計算Ca2i平均熒光強度6。16  細胞內(nèi)ROS檢測細胞用H2DCFDA/AM(Molecular Probes公司，美國)5g/mL，37標記30min。H2DCFDA進入細胞后，被細胞的酯酶轉(zhuǎn)化成H2DCF，后者非常容易被活性基團氧化，產(chǎn)生強熒光的2,7_dichlorofluorescein。H2DCF對各類ROS都非

13、常敏感7。用LSM510共聚焦激光掃描顯微鏡和Metamorph圖像分析軟件計算細胞內(nèi)ROS平均熒光值。17  統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 100統(tǒng)計軟件包對各熒光值進行ANOVA單因素方差分析，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用Students Newman_Keuls方法。2  結(jié)果21  損傷細胞隨牽張損傷程度加重而增多對照組中只有少量PI陽性細胞(圖1A，封3)，說明硅膠膜上的細胞生長良好，細胞膜完整，個別PI陽性細胞屬正常生理死亡細胞。各損傷組細胞經(jīng)牽張損傷后仍較好地貼壁于硅膠膜上，并隨著損傷級別的加重PI陽性細胞數(shù)隨之增加(圖1B1C，封3)。各損傷組與對照組比有統(tǒng)計

14、學(xué)意義(P001)，中度損傷組與輕度損傷組比有統(tǒng)計學(xué)意義(P005)，重度損傷組與中度損傷組比有統(tǒng)計學(xué)意義(P001)(圖2)。22  熒光恢復(fù)率隨牽張損傷程度加重而降低對照組與損傷組細胞熒光漂白后都有不同程度的恢復(fù)(圖3，封3)，說明細胞間有縫隙連接存在。輕度損傷組與對照組比熒光恢復(fù)率有所降低(P005)；中度和重度損傷組較對照組熒光恢復(fù)率明顯降低(P001)(圖4)。細胞經(jīng)含鈣DPBS和CBX處理后熒光恢復(fù)率較低，提示鈣有類似CBX的作用，可使縫隙連接通道趨于關(guān)閉。細胞經(jīng)SOD、EGTA處理后，熒光恢復(fù)率上升，與含鈣DPBS和CBX處理的細胞比P001(圖5)，但損傷組熒光恢復(fù)率

15、小于對照組，提示牽張損傷可通過Ca2i超載和ROS產(chǎn)生增多來降低平滑肌細胞縫隙連接細胞間通訊功能。         23  細胞內(nèi)鈣和ROS水平隨牽張損傷程度加重而升高隨著細胞牽張損傷的加重，Ca2i和ROS水平均升高(圖6，7)。經(jīng)含鈣DPBS處理后各組Ca2i水平均高于經(jīng)無鈣DPBS處理的細胞，其中各損傷組的升高更為明顯，與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P001)，說明細胞損傷后細胞外鈣內(nèi)流增加，損傷組細胞ROS水平較對照組升高(P001)。3  討論在中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷研究中，由于體外研究模型能

16、排除體內(nèi)損傷過程中各種復(fù)雜因素的作用，并能區(qū)分原發(fā)損傷和繼發(fā)損傷的細胞以及觀察單因素對某種細胞的影響，故近年來體外培養(yǎng)細胞損傷模型日益引起人們的重視810。根據(jù)生物力學(xué)研究得到的顱腦創(chuàng)傷發(fā)生時的力學(xué)參數(shù)發(fā)展起來的細胞牽張損傷裝置可近似地模擬在體腦創(chuàng)傷過程中細胞受壓、牽張變形的應(yīng)力變化11,12。此模型的優(yōu)點是致傷條件易控制，重復(fù)性好，可控制損傷程度等。這種精確的控制有利于比較細胞對生理或損傷變形的反應(yīng)，為研究顱腦損傷的病理機制和藥物作用提供一個有用手段。以往有關(guān)細胞牽張損傷模型的研究多集中于神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞3,4,812，而對血管平滑肌細胞在牽張損傷時的生理、病理和功能變化未見報道。A7

17、r5細胞是胚胎鼠主動脈的平滑肌細胞13，細胞培養(yǎng)易存活，分裂增殖迅速，易于貼壁，牽張損傷后細胞不脫落，損傷后的細胞有修復(fù)和再生能力，是研究體外創(chuàng)傷較理想的細胞。本實驗以A7r5細胞為牽張損傷對象，研究細胞牽張損傷時Ca2i、細胞內(nèi)ROS的變化與細胞通訊功能的改變?？p隙連接幾乎存在于所有的動物細胞中，是細胞之間的細胞膜蛋白通道，允許無機離子、氨基酸、葡萄糖、代謝產(chǎn)物和其它分子質(zhì)量小于12ku的物質(zhì)在細胞間通過，是細胞維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定最重要的一項功能?？p隙連接是一種動態(tài)結(jié)構(gòu)，能被各種正常和病理的刺激造成縫隙連接通道的開放和關(guān)閉。大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞的縫隙連接蛋白可被蛋白激酶A和蛋白激酶C磷酸化、解

18、偶聯(lián)14,15，NO、油酸和花生四烯酸可降低培養(yǎng)的皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞縫隙連接通道1618，紅藻氨酸鹽可減少大鼠海馬神經(jīng)元縫隙連接偶聯(lián)19，這些研究提示腦損傷、腦缺血、氧化劑可降低細胞通訊功能。本實驗觀察到牽張損傷細胞后細胞通訊功能降低。細胞損傷時細胞內(nèi)鈣庫釋放20，細胞Ca2通道開放，致大量Ca2內(nèi)流，以及Ca2外排減少，以上因素均導(dǎo)致Ca2超載，Ca2超載可激活脂肪酶、蛋白酶和核酸內(nèi)切酶等，導(dǎo)致細胞功能受損。ROS產(chǎn)生增多和Ca2i超載可互為因果21，ROS產(chǎn)生增多，可與細胞的膜磷脂、蛋白、核酸發(fā)生反應(yīng)，使細胞功能障礙和結(jié)構(gòu)破壞，影響鈣內(nèi)流；細胞膜脂質(zhì)過氧化和通透性增強，細胞外Ca2+內(nèi)流；膜

19、Na+_K+_ATP酶失活，使細胞內(nèi)Na+升高，Na+_Ca2+交換增強；線粒體膜損傷使ATP生成減少，后者使肌漿網(wǎng)鈣泵活性降低，肌漿網(wǎng)攝取Ca2+減少。反之，鈣超載導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，鈣敏感蛋白水解酶活性增高，促使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤氧化酶，自由基生成增加；鈣依賴性磷脂酶A2激活，使花生四烯酸生成增加，通過環(huán)加氧酶和脂加氧酶作用產(chǎn)生大量H2O2和OH；Ca2+沉積線粒體使細胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，O2經(jīng)單電子還原形成氧自由基增多；Ca2+進入線粒體可使MnSOD、過氧化氫酶和過氧化物酶活性下降，導(dǎo)致氧自由基清除減少。因此，ROS產(chǎn)生增多和Ca2i超載可互為因果，共同影響細胞功能。本實驗

20、提示細胞通訊功能降低與損傷細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多和Ca2i超載有關(guān)聯(lián)。參考文獻：1Ujiie H，Chaytor AT，Bakker LM，et al. Essential Role of Gap Junctions in NO_and Prostanoid_Independent Relaxations Evoked by Acetylcholine in Rabbit Intracerebral ArteriesJ. Stroke，2003，34(2)：544-550.2Lagaud G, Karicheti V，Knot HJ，et al. Inhibitors of gap juncti

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