結(jié)締組織生長(zhǎng)因子單克隆抗體超微超順磁氧化鐵粒子的制備及其生物活性的研究

1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子單克隆抗體超微超順磁氧化鐵粒子的制備及其生物活性的研究         11-03-25 16:00:00     編輯：studa20                    作者：吳媛，吳國(guó)球，劉乃,張松，張宇【摘要】  目的： 通過化學(xué)合成方法制作結(jié)締組織生長(zhǎng)

2、因子(connective tissue growth factor,CTGF)單克隆抗體超微超順磁氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)粒子分子探針，并檢測(cè)其生物活性。方法： 采用EDC(1ethyl33dimethylaminopropylcarbodiimide hydrochloride)化學(xué)連接劑將CTGF單克隆抗體與DMSAmeso2,3dimercaptosuccinic acid(HOOCCH(SH)CH(SH)COOH)修飾的USPIO相結(jié)合，形成具有免疫活性的分子探針。通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)及We

3、stern blotting方法檢測(cè)其生物穩(wěn)定性及免疫活性。結(jié)果： 隨著加入不同質(zhì)量的單克隆抗體，ELISA試驗(yàn)所得的吸光度值隨抗體含量增加而增大，與陰性對(duì)照USPIO組相比較差異顯著(P<0.05),分別間隔30 d及60 d后再次測(cè)量，只有200 g單抗組吸光度值降低(P<0.05)。Western blotting試驗(yàn)顯示，結(jié)合單抗的USPIO及單純單抗均顯示出條帶，且前者較淺，而單純USPIO對(duì)照組則未顯示條帶。結(jié)論：EDC化學(xué)方法可制備出結(jié)締組織生長(zhǎng)因子單克隆抗體超順磁氧化鐵粒子，同時(shí)仍具有抗體的生物活性及生物穩(wěn)定性。 【關(guān)鍵詞】  超微超順磁氧化鐵; 結(jié)締組織

4、生長(zhǎng)因子; 單克隆抗體; 生物活性近年分子影像學(xué)應(yīng)運(yùn)而生,發(fā)展迅速，Weissleder等1將分子影像學(xué)定義為“在細(xì)胞和分子水平對(duì)生物學(xué)過程進(jìn)行活體定性及測(cè)量的技術(shù)”。不斷出現(xiàn)的各種分子探針，能觀察代謝變化的分子成像技術(shù)，為闡明發(fā)病機(jī)制提供先進(jìn)手段24。心血管系統(tǒng)的分子影像學(xué)探針的開發(fā)與應(yīng)用體現(xiàn)出有用的價(jià)值,不同的靶向探針已開發(fā)用于不同的分子事件，如纖維蛋白、凋亡、血管生成等的成像56。超微超順磁氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)作為探針直徑小，能穿行于血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，可用于血管分子成像7。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectiv

5、e tissue growth factor，CTGF)在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,與動(dòng)脈粥樣硬化8、心肌梗死9、高血壓10、血管形成11有關(guān);同時(shí)是一種特異性更強(qiáng)的、選擇性干預(yù)病理改變過程的細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)將其單克隆抗體與USPIO通過化學(xué)方法相結(jié)合可以達(dá)到在活體水平動(dòng)態(tài)觀察及測(cè)量的目的，對(duì)于研究心血管疾病的發(fā)展及早期診斷有著重要的意義。1 材料與方法1.1 材料DMSA修飾的USPIO(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程系制備);重組CTGF及CTGF單抗(本實(shí)驗(yàn)室制備);辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠抗體，Biomat高吸附酶標(biāo)板(上海晶美公司);EDC(美國(guó)Sigma公司);全自

6、動(dòng)洗板機(jī)(美國(guó)BioRad公司);蛋白質(zhì)Marker(美國(guó)BioRad公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Sigma公司)。1.2 方法PAGE凝膠分離，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,之后用PBST溶液(1Tween20,0.1 mol·L-1,pH 7.4)漂洗，室溫下用含有5%脫脂奶粉封閉2 h。分別將結(jié)合單克隆抗體100 g的USPIO及未結(jié)合單抗的USPIO稀釋10倍后與PVDF膜一起孵育，4 過夜。PBST漂洗3次，置于搖床室溫，每次10 min。加入用PBST稀釋的二抗，與膜共孵育，置于搖床室溫2 h。用PBST漂洗3次，置于搖床室溫，每次10 min。濾紙吸干膜上的水分，將膜移至干燥的保鮮膜

7、上，ECL液均勻滴加在PVDF膜上，用保鮮膜包住PVDF膜，放在夾板上，剪一張稍大于PVDF膜的膠片覆蓋于膜，夾緊夾板，曝光后分別置于顯影液、定影液中顯影，即可觀察條帶。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x-±s表示，統(tǒng)計(jì)分析采用oneway ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，若P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 ELISA試驗(yàn)檢測(cè)CTGF單克隆抗體超微超順磁氧化鐵納米粒子及生物活性、穩(wěn)定性 加入不同質(zhì)量單克隆抗體(25、50、100、200 g)與USPIO(0.1 mg)反應(yīng)后，所得生成物于波長(zhǎng)450 nm/630 nm處測(cè)得各濃度吸光

8、度值分別為0.517±0.128、0.891±0.194、1.185±0.122、1.633±0.048。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PBST組與單純USPIO對(duì)照組相比無顯著差異(0.057±0.013 vs 0.088±0.020，P>0.05);單純USPIO對(duì)照組與不同質(zhì)量各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同質(zhì)量單克隆抗體(25、50、100、200 g)與USPIO(0.1 mg)反應(yīng)后生成物，于PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.0)溶液中4 保存30 d及60 d后，再次洗滌3次并重懸浮于1 ml PBS(0.1 mol·L-1,pH 7.0)溶液中，于波長(zhǎng)450 nm/630 nm處測(cè)得各濃度吸光度值，并求其平均值(n=3)，結(jié)果如圖1。200 g組0、30、60 d間吸光度值比較明顯降低，差異顯著(P<0.05)，其余各組0、30、60 d間吸光度值比較無顯著差異(P>0.05)。2.2 Western blotting檢測(cè)生物活性結(jié)果分別檢測(cè)100 g單克隆抗體標(biāo)記US