糖胺聚糖對受刺激內(nèi)皮細胞組織因子和凝血酶調(diào)節(jié)蛋白表達的影響

1、    糖胺聚糖對受刺激內(nèi)皮細胞組織因子 和凝血酶調(diào)節(jié)蛋白表達的影響        【摘要】目的研究由玉足海參提取的糖胺聚糖(GAG)抗血栓形成作用的機制。方法分別用1mg/L、5mg/L、10mg/L的GAG和5mg/L 肝素與經(jīng)1mg/L細菌脂多糖(LPS)誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞孵育，6h后觀察內(nèi)皮細胞的促凝活性、組織因子(TF)和凝血酶調(diào)節(jié)蛋白(TM)抗原的表達及TF和TM mRNA轉(zhuǎn)錄的變化。結果GAG降低受刺激內(nèi)皮細胞的促凝活性、TF抗原的表達和TF mR

2、NA的轉(zhuǎn)錄,升高TM抗原的表達和TM mRNA的轉(zhuǎn)錄。結論下調(diào)受刺激內(nèi)皮細胞TF表達的同時上調(diào)TM表達可能是GAG發(fā)揮抗血栓形成作用的主要機制之一?！娟P鍵詞】糖胺聚糖；內(nèi)皮細胞；凝血酶致活酶；組織因子；凝血酶調(diào)節(jié)蛋白；肝素 Effects of holothuria glycosaminoglycan on the expression of tissue factor and thrombomodulin in stimulated endothelial cellsLI Zhiguang,WANG Xuefeng,WANG Hongli,et al.Shanghai Institute o

3、f Hematology,Ruijin Hospital,Shanghai Second Medical University,Shanghai200025，China【Abstract】ObjectiveTo study the mechanism of antithrombotic effects of holothuria glycosaminoglycan(GAG).MethodsEndothelial cells from human umbilical vein which were pre-induced with 1mg/L lipopolysaccharide,were tr

4、eated by GAG(1mg/L,5mg/L,and 10mg/L,respectively)and 5mg/L heparin as a control for 6 hours.Procoagulant activity(PCA),the expressions of tissue factor(TF) antigen and thrombomodulin(TM) antigen and their mRNA transcriptions were investigated.ResultsGAG could down-regulate the expression of TF antig

5、en and mRNA,up-regulate the expression of TM antigen and mRNA,down-regulate the PCA of stimulated endothelial cells.ConclusionDown-regulating TF expression and up-regulating TM expression of stimulated endothelial cells may be one of the mechanisms of GAG antithrombosis.【Key words】Glycosaminoglycan；

6、Endothelial cells；Thromboplastin;Tissue factor；Thrombomodulin;Heparin海參糖胺聚糖（holothuria glycosaminoglycan, GAG）是從玉足海參體壁中提取的一種含巖藻糖（L-fucose）的糖胺聚糖。經(jīng)臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)，GAG具有抗凝、降低血粘度、降低血脂等作用1-3，但對其作用機制了解甚少。在血管內(nèi)皮細胞表面存在兩類調(diào)節(jié)血液凝固的細胞成分,主要是抗凝成分凝血酶調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin,TM）和促凝成分的組織因子（tissue factor,TF）。炎癥介質(zhì)如內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、

7、白細胞介素1(IL-1)可抑制TM表達,增高TF表達4,5。為了闡明GAG抗血栓形成的作用機制，我們研究了GAG對經(jīng)細菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）TF和TM表達的影響。材料和方法1細胞培養(yǎng)按Jaffe等的方法6制備人臍靜脈內(nèi)皮細胞，用1g/L膠原酶（Sigma公司產(chǎn)品）消化臍靜脈內(nèi)皮細胞，將3×105細胞濃度的細胞接種于24孔培養(yǎng)板，經(jīng)34d的培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察接種的內(nèi)皮細胞的生長至完全融合后用于實驗。將培養(yǎng)的HUVECs分為6個實驗組

8、：對照組：對培養(yǎng)的細胞不經(jīng)任何處理；LPS誘導組：向細胞培養(yǎng)液內(nèi)加入LPS至終濃度1mg/L；肝素組：向培養(yǎng)液內(nèi)同時加入LPS和肝素（上海生化制藥廠），使終濃度分別為1mg/L和5mg/L；LPS加1mg/L GAG組：向培養(yǎng)液內(nèi)同時加入LPS和GAG（江蘇省常州華利康海洋生物有限公司提供），使它們的終濃度均為1mg/L；LPS加5mg/L GAG組：向培養(yǎng)液內(nèi)同時加入LPS和GAG，使終濃度分別為1mg/L和5mg/L；LPS加10mg/L GAG組：向培養(yǎng)液內(nèi)同時加入LPS和GAG，使終濃度分別為1mg/L和10mg/L。培養(yǎng)6h后檢測。2HUVECs促凝活性（PCA）的檢測細胞培養(yǎng)結束后

9、，將培養(yǎng)板置于冰上，棄去培養(yǎng)液，然后用冰預冷的磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）洗細胞3次，利用細胞刮板將每孔的細胞收集于500l冰預冷的PBS中，以12000×g、4 離心20min，用50l冰預冷的PBS重懸細胞。以此細胞懸液加等體積正常人混合血漿于37孵育180s后，加50l 0.05mol/L CaCl2結果1GAG對HUVECs的PCA的影響經(jīng)1mg/L LPS刺激后，HUVECs的PCA增高近3倍。與LPS誘導組相比，用1mg/L和10mg/L的GAG與LPS同時處理內(nèi)皮細胞，其PCA有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。5mg/L GAG和5mg/L肝素與

10、LPS共同處理HUVECs，其PCA與LPS刺激組相比顯著下降（P<0.05）（見表1）。表1GAG對HUVECs PCA、TF:Ag和TM:Ag表達的影響組別nPCA (U/孔)TFAg(pg/mg細胞蛋白)TMAg(ng/mg細胞蛋白)對照組21.19±0.144033.31±157.981631.70±31.88LPS誘導組33.12±0.4114829.27±754.47669.41±51.25肝素組31.87±0.02*8899.43±233.72#1254.20±79.03#LPS加1m

11、g/L GAG組31.94±0.3312673.01±668.84*1161.74±15.49LPS加5mg/L GAG組31.68±0.05*7418.59±239.99#1787.84±82.62#LPS加10mg/L GAG組32.38±0.309021.37±716.57#1391.84±25.53#     注：與LPS誘導組相比，*P<0.05；P<0.005；#P<0.0012GAG對HUVECs的TFAg和TMAg表達的影響經(jīng)LPS

12、刺激后，HUVECs的TFAg表達顯著增高（P<0.001），TMAg表達顯著下降（P<0.001）。分別用5mg/L肝素,1mg/L 、5mg/L、10mg/L的GAG和LPS共同處理內(nèi)皮細胞時，與LPS誘導組相比TFAg表達都明顯下降（P分別<0.001,<0.05,<0.001,<0.001），TMAg表達顯著升高（P分別<0.01,<0.005,<0.001,<0.001）。其中LPS加5mg/L GAG 組與肝素組和LPS加1mg/L GAG組相比TFAg水平亦有顯著下降（P<0.005）。LPS加5mg/L GAG組

13、與肝素組、LPS加1mg/L GAG組和LPS加10mg/LGAG組相比,TMAg水平亦有顯著升高（P分別<0.005,<0.001,<0.005）（見表1）。3GAG對內(nèi)皮細胞TF和TM mRNA轉(zhuǎn)錄的影響未經(jīng)LPS處理的HUVECs TF mRNA轉(zhuǎn)錄水平很低，經(jīng)LPS誘導后TFmRNA轉(zhuǎn)錄有所增強。各GAG組和肝素組的TF mRNA轉(zhuǎn)錄下降。LPS處理后，內(nèi)皮細胞TM mRNA轉(zhuǎn)錄下降，用5mg/L肝素，1mg/L 、5mg/L和10mg/L的GAG與LPS共同作用于內(nèi)皮細胞，TM mRNA轉(zhuǎn)錄有所增強（見1）。     M為Ma

14、rker;16為GAG對TM mRNA表達的影響;af為GAG對TF mRNA表達的影響;1和a為對照組;2和b為LPS刺激組;3和c為肝素組;4和d為LPS加1mg/L GAG組;5和e為LPS加5mg/L GAG組;6和f為LPS加10mg/L GAG組1GAG對HUVECs的TF 和TM mRNA表達的影響討論TF是一個相對分子質(zhì)量為47×103的膜結合糖蛋白，它是凝血因子/a的受體和輔助因子，TFa復合物具有水解活性，可以將因子和因子轉(zhuǎn)化為活化的因子a和a，從而生成凝血酶和纖維蛋白8。生理情況下，TF不與血液接觸，在血管損傷時入血，激活外源性凝血途徑，形成纖維蛋白凝塊，從而減

15、少和阻止出血或血栓形成。正常的內(nèi)皮細胞表面不表達TF，炎性物質(zhì)如LPS、IL-1、TNF以及凝血酶等可誘導內(nèi)皮細胞TF的表達。炎性物質(zhì)刺激的內(nèi)皮細胞可作為細胞損傷模型，以研究病理狀態(tài)下細胞生物學活性的改變9。TM是位于內(nèi)皮細胞表面的一種高親和性的凝血酶受體。輔助活化蛋白C(APC)通過與凝血酶結合來改變凝血酶的促凝活性。APC可以滅活a和a，發(fā)揮抗凝作用。所以，凝血酶-TM途徑是內(nèi)皮細胞生理抗凝機制之一。細胞因子和內(nèi)毒素在上調(diào)TF的同時可以下調(diào)TM10。肝素屬GAGs類, 它能在轉(zhuǎn)錄水平抑制內(nèi)皮細胞和單核細胞TF mRNA的表達11，并能抑制受損的內(nèi)皮細胞TM的釋放12。海參GAG是從玉足海參

16、體壁中提取出的一種含硫酸糖胺聚糖。我們的臨床研究證明GAG具有抗凝血作用、降低血粘度作用和降低血脂作用3。但對GAG的抗凝機制的研究報道甚少。我們從HUVECs的TF和TM蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平及總體PCA方面進行了研究。結果表明，GAG可以降低LPS誘導的HUVECs的TF抗原的表達和TF mRNA的轉(zhuǎn)錄，同時升高TM抗原的表達和TM mRNA的轉(zhuǎn)錄，降低內(nèi)皮細胞表面的PCA，從而發(fā)揮抗凝作用。這可能是GAG發(fā)揮抗凝作用的主要機制之一。我們研究了1mg/L 、5mg/L 和10mg/L的GAG三個劑量組的差異，發(fā)現(xiàn)5mg/L組的作用明顯優(yōu)于1mg/L 和10mg/L組，說明高于一定濃度的GAG的

17、作用反而降低。最近，Imanari等13進行了GAGs的藥物代謝動力學方面的研究，發(fā)現(xiàn)GAGs的代謝動力學非常復雜，并且是非劑量依賴的。臨床用藥劑量為60mg/d或120mg/d，此劑量的血藥濃度低于5mg/L，具有良好的抗凝作用。這提示臨床用藥的劑量不宜過大。至于高濃度GAG抗凝作用下降的機制以及GAG發(fā)揮抗凝作用的深層機制有待進一步研究。 基金項目:衛(wèi)生部科學研究基金資助項目（98-1-310）；胡應洲基金部分資助項目作者單位：李志廣（200025上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學研究所）王學鋒（200025上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學研究所）王鴻利（20002

18、5上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學研究所）郭為民（200025上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學研究所）劉元?（200025上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學研究所）璩斌（200025上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學研究所）郭雪梅（200025上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學研究所）儲海燕（200025上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院、上海血液學研究所）參 考 文 獻3，王學鋒，王鴻利，胡大萌，等.玉足海參酸性粘多糖（抗栓膠囊）抗血栓形成作用的觀察.中華血液學雜志，1997，18：457-459.4，Ryan J,Geczy C.Coagulation and

19、the expression of cell-mediated immunity.Immunol Cell Biol，1987，65:127-139.6，Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical cord veins.Identification and immunological criteria.J Clin Invest,1973，52:2745-2756.7，Koyama T,Hirosawa S,Kawamata N,et al.All-t

20、rans retionic acid upregulates thrombomodulin and downregulates tissue factor expression in acute promyelocytic leukemia cells: distinct expression of thrombomodulin and tissue factor in human leukemia cells.Blood，1994，84:3001-3009.8，Edgington TS,Mackman N,Brand K,et al.The structural biology of expression and function of tissue factor.Thromb Haemost，1991，66:67.9，Colrcci J,Balconi G,Lorenzet R,et al.Cultured human endothelial cells generate tissue factor in response to endotoxin.J Clin Invest，1983，71:1893-1896.10，Wharam BL,Fitting K,Kunkel SL,et al.Tissue factor expression in endothelial