雌激素受體在支氣管哮喘患者肥大細(xì)胞上的表達(dá)及其意義

1、 醫(yī)學(xué)論文免費下載雌激素受體在支氣管哮喘患者肥大細(xì)胞上的表達(dá)及其意義作者：程 立1,4, 劉先勝4*, 王成國1, 程范軍2, 朱正鵬3 作者單位：(鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院1呼吸內(nèi)科;2血液內(nèi)科;3病理科,湖北 十堰 442008;4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸內(nèi)科,湖北 武漢 430030)【摘要】 目的：研究雌激素受體在支氣管哮喘患者支氣管粘膜肥大細(xì)胞中的表達(dá)及意義。方法：采用抗人肥大細(xì)胞類胰酶單克隆抗體、抗人雌激素單克隆抗體對12例支氣管哮喘患者支氣管粘膜標(biāo)本進(jìn)行免疫組化及雙標(biāo)免疫染色。結(jié)果：雌激素受體陽性細(xì)胞與肥大細(xì)胞相似、位置相吻合。結(jié)論：支氣管哮喘患者的支氣管粘膜中肥大細(xì)

2、胞表達(dá)雌激素受體，提示雌激素參與呼吸道變態(tài)反應(yīng)以及炎性疾病?！娟P(guān)鍵詞】 支氣管哮喘;肥大細(xì)胞;雌激素受體The expression of Estrogen Receptors in Mucosal Mast Cells in Bronchial Asthma Patients and its Clinical Significance CHENG Li1,4,LIU Xiansheng4*,WANG Chengguo1,CHENG Fanjun2,ZHU Zhengpeng3 (1Department of Respiratory Diseases,2Department of Hemato

3、logy,3Department of Pathology,Dongfeng Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442008;4Department of Respiratory Diseases,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030,China)Abstract: Objective To explore the expression of estrogen rece

4、ptors in mucosal mast cells in bronchial asthma patients and its clinical significance.Methods With monoclonal antibodies against human mast cell pancreatin and human estrogen receptors,immunohistochemical and dual immunostaining methods were used to detect and locate mast cells from 12 cases of bro

5、nchial asthma mucosal specimens.Results The estrogen receptor positive cells were coincided highly with mast cells in morphology and location.Conclusion The expression of estrogen receptors in mucosal mast cells in bronchial asthma patients indicates that estrogen may involve in respiratory allergy

6、and inflammatory diseases.Key words: Bronchial asthma;Mast cells;Estrogen receptor肥大細(xì)胞是變態(tài)反應(yīng)和炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。有報道發(fā)現(xiàn)女性支氣管哮喘患者的呼吸道癥狀隨卵巢激素水平變化而變化1-2。也有研究證實雌激素及其受體在變態(tài)反應(yīng)和炎性反應(yīng)性疾病中起重要作用1-4。人上呼吸道變態(tài)反應(yīng)和炎性反應(yīng)疾病的粘膜組織含有大量的雌激素受體(Estrogen receptor，ER)陽性細(xì)胞，其形態(tài)、大小和組織分布頗與肥大細(xì)胞相似5-6。但人類下呼吸道粘膜肥大細(xì)胞是否有雌激素受體存在尚未證實。本研究通過免疫組化染色方法測

7、定支氣管哮喘患者的支氣管粘膜中肥大細(xì)胞是否存在雌激素受體，以探討雌激素是否參與呼吸道變態(tài)反應(yīng)和炎性反應(yīng)性疾病的病理及發(fā)生機(jī)制。1 材料與方法1.1 組織標(biāo)本12例接受經(jīng)纖維支氣管鏡活檢的支氣管哮喘患者(符合GINA2006診斷標(biāo)準(zhǔn))，其中男5例，女7例，年齡2346歲。每位患者鉗取粘膜組織2塊，大小約3 mm×2 mm×2 mm，福爾馬林固定，石蠟包埋待用。1.2 試劑即用型鏈酶親和素生物素過氧化酶復(fù)合物免疫組化(SABC)試劑盒、SABCAP試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、BCIP/NBT顯色試劑盒、氨丙基三乙氧劑硅烷(APES)切片粘合劑(武漢博士德生物工程公

8、司);抗人肥大細(xì)胞類胰酶單克隆抗體(深圳晶美公司);抗人雌激素單克隆抗體 (福建邁新公司)。單抗均以Tris緩沖液(TBS，pH 7.4)稀釋至工作濃度1100。1.3 免疫組化染色方法行肥大細(xì)胞、雌激素受體免疫組化染色。石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，厚度4 m，經(jīng)脫蠟水化、滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，0.1%胰酶37 水浴消化20 min，TBS沖洗，非免疫性動物血清封閉，每張切片再滴加50 L抗人肥大細(xì)胞類胰酶單克隆抗體(或抗人雌激素受體抗體)，室溫下孵育，加50 L生物素標(biāo)記的二抗和即用型SABC，DAB顯色。1.4 免疫組化雙染方法切片經(jīng)二甲苯脫蠟，系列酒精水化，依次行阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、微波修復(fù)抗

9、原、非免疫性動物血清封閉后，滴加濃度為1100抗人肥大細(xì)胞單克隆抗體，37 孵育30 min，TBS液洗滌;滴加50 L生物素標(biāo)記的二抗，37 孵育30 min;滴加濃度為1100 SABC 37 45 min;采用DAB顯色試劑盒顯色;滴加雙摘阻斷液，并行血清封閉后，滴加50 L抗人雌激素單克隆抗體，37 水浴30 min;滴加50 L生物素標(biāo)記的二抗，37 孵育30 min;滴加即用型SABCAP液，37 45 min;采用BCIP/NBT避光顯色320 min呈紫藍(lán)色后，以蒸餾水充分洗滌終止反應(yīng)。1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果分析MC判定標(biāo)準(zhǔn):tryptase陽性細(xì)胞呈棕黃色，胞漿內(nèi)可見棕黃/褐

10、色顆粒，胞核亦呈棕黃/褐色。MC計數(shù)方法:參照Molin7方法,高倍鏡下隨機(jī)觀察10個視野，計數(shù)各視野內(nèi)MC數(shù)，求其均值。ER陽性判定標(biāo)準(zhǔn)8:以細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒,且著色明顯高于背景者定為ER陽性細(xì)胞，高倍鏡下選取10個不同視野,計數(shù)各視野內(nèi)ER陽性細(xì)胞數(shù)，求其均值。通過連續(xù)切片光鏡下對ER陽性細(xì)胞和MC進(jìn)行對比觀察，并分析兩者的相關(guān)性。ER陽性細(xì)胞和肥大細(xì)胞相關(guān)性判定：用連續(xù)切片對ER陽性和肥大細(xì)胞的數(shù)目和組織分布進(jìn)行對比觀察，每張切片選擇5個含有最多陽性細(xì)胞的高倍視野進(jìn)行計數(shù)，每份標(biāo)本的陽性細(xì)胞數(shù)以平均陽性細(xì)胞數(shù)/高倍視野表示。1.6 統(tǒng)計分析兩者之間的相關(guān)性用Towtailed Pear

11、son Bivariate相關(guān)分析處理(SPSS11.0)，并進(jìn)行t檢驗，P<0.05時被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 肥大細(xì)胞、雌激素受體陽性細(xì)胞染色結(jié)果光鏡下MC為圓形或橢圓形，被染成棕黃色，呈彌散分布，以血管周圍多見;胞漿內(nèi)可見棕黃/褐色顆粒，胞核亦呈棕黃/褐色，其周圍可見散在分布的tryptase陽性顆粒，ER陽性細(xì)胞主要是細(xì)胞核被染成棕黃色的ER陽性細(xì)胞。間質(zhì)中的ER陽性細(xì)胞與MC的形態(tài)特征相似(見圖12)。2.2 雌激素受體陽性細(xì)胞與肥大細(xì)胞相關(guān)性雌激素受體陽性細(xì)胞與肥大細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征有相似之處;MC計數(shù)5.67±4.35，ER陽性細(xì)胞計數(shù)15.16±

12、7.49，其中間質(zhì)中的ER陽性細(xì)胞為3.84±3.08。MC與粘膜間質(zhì)中的ER陽性細(xì)胞存在正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.845(P<0.01)。2.3 支氣管粘膜肥大細(xì)胞可表達(dá)雌激素受體免疫組化雙染結(jié)果示：鏡下可見粘膜肥大細(xì)胞被染成棕紅色，雌激素受體位于肥大細(xì)胞胞漿中，并被染成深藍(lán)色，與細(xì)胞位置吻合(見圖3a、3b)。3 討論雌激素具有促進(jìn)抗體生成、增強(qiáng)肥大細(xì)胞釋放組織胺、延遲嗜酸性細(xì)胞凋亡和嗜酸性細(xì)胞趨化作用。以往研究證實，應(yīng)用雌激素可使哮喘、過敏反應(yīng)、自身免疫等疾患癥狀惡化9-11，并可加重支氣管哮喘患者焦慮抑郁狀態(tài)12。雌激素亦可通過誘導(dǎo)生長因子受體的表達(dá)，使肥大細(xì)胞數(shù)目增多13

13、，并能增強(qiáng)肥大細(xì)胞釋放組織胺能力14。上述結(jié)果提示雌激素可通過改變肥大細(xì)胞的功能引起氣道高反應(yīng)性或者支氣管哮喘，故推測肥大細(xì)胞可能是連接雌激素和氣道高反應(yīng)性或者支氣管哮喘之間的重要紐帶。但目前關(guān)于雌激素對呼吸道變態(tài)反應(yīng)的靶點和可能的細(xì)胞學(xué)機(jī)制仍未闡明?？谷朔蚀蠹?xì)胞類胰酶抗體標(biāo)識肥大細(xì)胞是目前檢測肥大細(xì)胞數(shù)目和活性的先進(jìn)方法，具有很高的特異性和敏感性。目前免疫組化染色法因能在組織原位顯示雌激素受體信號并排除因非相關(guān)蛋白污染而造成假陽性的可能，故被認(rèn)為是最好的方法。本研究運用該方法，在同一標(biāo)本連續(xù)切片上觀察細(xì)胞的位置和形態(tài)，發(fā)現(xiàn)雌激素受體陽性細(xì)胞似與肥大細(xì)胞吻合，相關(guān)分析處理，兩者相關(guān)系數(shù)為0.8

14、45，證明該方法成功可靠 。Zhao等15應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測鼻息肉內(nèi)雌激素受體的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)除肥大細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞均不表達(dá)雌激素受體。Harnden等16在研究間質(zhì)性膀胱炎的膀胱粘膜時也發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞單獨表達(dá)雌激素受體。Mollerup5和Fagan6發(fā)現(xiàn)人上呼吸道變態(tài)反應(yīng)和炎性反應(yīng)疾病的粘膜組織含有大量的雌激素受體，其形態(tài)、大小和組織分布與肥大細(xì)胞相似，但支氣管哮喘患者支氣管粘膜肥大細(xì)胞是否也存在雌激素受體未知。本研究采用抗人肥大細(xì)胞類胰酶單克隆抗體、抗人雌激素單克隆抗體對支氣管粘膜標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化雙標(biāo)染色，結(jié)果證實支氣管哮喘患者的支氣管粘膜中肥大細(xì)胞表達(dá)雌激素受體

15、。本研究中，每例肥大細(xì)胞和ER陽性細(xì)胞表達(dá)的強(qiáng)弱不同，同一標(biāo)本的連續(xù)切片上肥大細(xì)胞和ER陽性細(xì)胞的積分也不同。盡管肥大細(xì)胞和ER陽性細(xì)胞明顯相關(guān)，但肥大細(xì)胞陽性積分高于ER陽性細(xì)胞者占多數(shù)(56%)，表明并非所有肥大細(xì)胞均可恒定地表達(dá)雌激素受體，而這種表達(dá)上的差異是否與肥大細(xì)胞異型性有關(guān)則需進(jìn)一步研究。所有類固醇激素都是通過結(jié)合相應(yīng)受體作用于靶細(xì)胞而發(fā)揮生物效應(yīng)的，組織中相應(yīng)受體的存在是組織對該激素敏感的最好標(biāo)志，這一結(jié)果不僅為雌激素對呼吸道的作用提供了直接的免疫學(xué)依據(jù)，而且對揭開雌激素參與支氣管哮喘等呼吸道變態(tài)反應(yīng)以及炎性反應(yīng)疾病的發(fā)病機(jī)理將有理論和實用價值。本研究結(jié)果也可能有助于解釋支氣管

16、哮喘在女性圍月經(jīng)期加重的現(xiàn)象。(文中圖13見封二)【參考文獻(xiàn)】1Herrington DM,Howard TD,Hawkins GA,et al.Estrogenreceptor polymorphisms and effects of estrogen replacement on high density lipoprotein cholesterol in women with coronary diseaseJ.N Engl J Med,2002,346(13):967-974.2Lu H,Higashikata T,Inazu A,et al.Association of estro

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