【學習】第十二章基因組研究技術

1、編輯ppt第十二章第十二章 基因組研究技術基因組研究技術編輯pptv 基因組v一個生物的基因組蘊含了該生物體全部的遺傳信息，即為整套染色體所含有的全部DNA序列v 現(xiàn)代基因組測序技術迅猛發(fā)展，已產生許多物種龐大的基因組序列信息v 基因組學（genomics）以基因組序列數(shù)據(jù)為出發(fā)點，從整體水平上研究基因的存在、結構與功能、基因間相互關系，甚至于染色體分子水平的結構特征以及不同物種基因組之間的進化關系等，最終系統(tǒng)地解碼生命編輯ppt第一節(jié)第一節(jié) 傳統(tǒng)基因組研究技術傳統(tǒng)基因組研究技術 在基因組學新興之初，獲得生物體基因組DNA序列 是研究關注的焦點 基因組測序基本策略：整個基因組DNA隨機打斷各小

2、片段逐一測序按位置關系排列組裝各測序小片段 基因組圖譜精確指導測序拼接：遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜遺傳圖譜、物理圖譜、序列圖譜和功能圖譜功能圖譜編輯ppt一一. 基因組遺傳圖譜的構建基因組遺傳圖譜的構建遺傳作圖（genetic mapping）是對某個未知真核生物基因組中的遺傳信息（或者是控制某個性狀的基因）在染色體上的位置和分布狀況進行初步確定1. 遺傳作圖標記標記 位于染色體上 易于檢測識別 個體間多態(tài)性 穩(wěn)定遺傳 形態(tài)標記 DNA標記 限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP） 簡單序列長度多態(tài)性（SSLP） 單核苷酸多態(tài)性（SNP）編輯ppt2. 遺傳作圖的方法（1）遺傳作圖的遺傳學原理

3、孟德爾遺傳學的連鎖和交換定律 基因交換頻率與在染色體上的間隔距離成正比 利用重組率判斷基因在染色體上相對位置（2）不同模式生物的連鎖分析 有性雜交實驗連鎖分析 系譜分析作圖 細菌（無減數(shù)分裂）轉化、轉導和結合轉 移頻率編輯ppt二二. 基因組物理圖譜的構建基因組物理圖譜的構建遺傳圖的分辨率有限遺傳圖的覆蓋面較低遺傳分子標記排列有時會出錯1. 限制性作圖在基因組上標定限制性酶切位點的相對位置主要適合對小基因組的原核生物和大片段進行限制性位點分析編輯ppt2. DNA大片段重疊克隆的基因組作圖先構建基因組的大片段基因文庫然后根據(jù)克隆片段之間的重疊順序構建重疊群(contig)，從而繪制物理連鎖圖3

4、. 熒光標記原位雜交作圖fluorescent in situ hybridzation，F(xiàn)ISH通過熒光標記的探針與染色體雜交，從而確定分子標記在染色體上的實際物理位置4. 序列標簽位點作圖sequence tagged site，STS通過PCR或分子雜交將序列標簽小段DNA序列在基因組DNA中進行定位可用于構建最為詳細的大基因組物理圖編輯ppt編輯ppt5. 基因組光學圖譜OpGen公司開發(fā)光學圖譜：來源于細菌、酵母或者真菌的單個基因組DNA分子有序、高信息含量的限制性酶切位點的圖譜做法：（1）溫和裂解細胞，抽提長的基因組DNA分子（2）微流體裝置將單個DNA分子在光學芯片上錨成平行陣列

5、（3）原位限制性消化錨定DNA分子并染色（4）分析軟件測量酶切產生片段大小和順序（5）光信號轉換成數(shù)字信號，獲得單分子光學圖譜編輯ppt編輯ppt三三. 基因組測序基因組測序1. 大規(guī)模基因組測序方法學改進454測序技術、Solexa測序技術、SOLiD測序技術和單分子測序技術（具體測序原理見第九章）2. 基因組DNA序列的確定（1）通過鳥槍法拼接序列染色體DNA隨機打斷成小片段測序小片段檢測短序列間可能的重疊區(qū)逐級拼接、推導出完整序列（2）克隆重疊群法測序技術在鳥槍法基礎上發(fā)展起來編輯ppt編輯ppt3. 人類基因組測序 人類基因組計劃1999年正式實施，2003年全部完成 國際人類基因組測

6、序協(xié)調組：圖譜測序方法（物理圖譜、鳥槍法） 美國Celera Genomics公司：全基因組鳥槍法 兩種測序結果和分析：2001年發(fā)表在Nature和Science雜志上編輯ppt第二節(jié)第二節(jié) 現(xiàn)代基因組研究技術現(xiàn)代基因組研究技術隨著生命科學領域技術的飛速發(fā)展，只停留在傳統(tǒng)基因組學時代里獲得生物全基因組序列、重點關注單個或少數(shù)基因表達調控，已滿足不了科學發(fā)展的需要后基因組時代使命：把一個基因組或一類基因組作為一個獨立單位，來研究眾多基因是如何精妙地組織構成基因組、基因組之間的進化關系和演化方向以及基因組僅靠靜態(tài)的核酸序列是如何在瞬息萬變中有條不紊地指揮生命的。編輯ppt一一. 基因組序列的解讀

7、基因組序列的解讀1. 通過序列分析查找基因 尋找基因的開放閱讀框 借助序列的同源性尋找基因常用軟件：TWINSCAN(Korf 等，2001)和SGP2(syntenic gene prediction tool)(Parra G等, 2003)編輯ppt2. 確定基因的實驗技術 分子雜交檢驗某一片段是否含有表達序列DNA-mRNA的雜交分析（Northern雜交） EST和cDNA測序有助于鑒定基因 確定轉錄物末端cDNA末端快速擴增（rapid amplification of cDNA end，RACE） 異源雙鏈分析 外顯子捕獲編輯ppt二二. 基因功能的預測和驗證基因功能的預測和驗證

8、1. 利用生物信息學分析基因功能同源性檢索：利用氨基酸序列進行同源性檢索得到的假陽性可能會較少BLAST（Basic local alignment sequence tool）2. 用實驗手段確定基因功能 反向遺傳學 基因失活基因敲除、TDNA插入突變體庫、RNA干擾、反義RNA等 基因超量表達探索基因功能 overexpression 目的基因異源表達3. 基因編碼的蛋白質功能的深入研究定點誘變、報告基因和免疫細胞化學、噬菌體表面展示、酵母雙雜交等編輯ppt三三. 功能基因學研究技術功能基因學研究技術單一基因或蛋白的研究多基因或蛋白系統(tǒng)研究基因組或系統(tǒng)水平上功能基因組學（后基因組學）編輯p

9、pt1. 轉錄組學相關研究技術基因的表達譜能顯示基因在細胞中的作用，也能幫助鑒定它與其他基因在功能上的聯(lián)系用于全局分析基因表達情況的技術：（1）cDNA-AFLP（cDNA-amplified fragment length polymorphism）（2）差異顯示PCR（differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR）（3）抑制性扣除雜交（suppression subtractive hybridization，SSH）（4）基因表達系統(tǒng)分析（serial analysis of gene expression, SAGE）編

10、輯ppt編輯ppt（5）微陣列技術（microarray）（6）轉錄組測序技術2. 蛋白質組學相關研究技術蛋白質才是生物系統(tǒng)中最終端、最關鍵的成分，必須對蛋白質展開直接研究（1）雙向凝膠電泳（two dimensional gel electrophoresis，2DGE）（2）定量蛋白質組學技術（quantitative proteomics）基于質譜技術的方法：同位素定量標記方法（iTRAQ）&非標記定量方法（label free）（3）蛋白質相互作用和相互作用組酵母雙雜交技術、細菌雙雜交技術、噬菌體表面展示技術、蛋白質芯片技術編輯ppt編輯ppt3. 代謝組學相關研究技術對某一生

11、物或細胞所有低相對分子量代謝產物進行定性和定量分析代謝組的分析技術包括： 化合物的分離氣相色譜（gas chromatography, GC）液相色譜（liquid chromatography, LC）毛細管電泳（capillary electrophoresis, CE）等 檢測及鑒定技術質譜、光譜、核磁共振、電化學等編輯ppt4. 基因組學研究展望v 編碼序列僅占全基因組12%v剩下基因組99%的序列一無所知可能蘊藏新式遺傳語言v2011年，首次繪制出了人類基因組的3D圖譜v染色體互作、染色體架構基因表達調控更高級模式v 立體化高級基因組遺傳語言闡明生命本質編輯ppt第三節(jié)第三節(jié) 基因組

12、工程基因組工程一一. 基因工程與基因組工程基因工程與基因組工程切割、重組遺傳基因人為期望產物新遺傳特征的生物類型基因工程基因組工程達到相應目的大片段基因（簇）功能分析去除非必需遺傳區(qū)域染色體可控重組編輯ppt1. 操作的基因和載體基因工程：質粒和病毒載體 kb級工程性遺傳操作基因組工程：人工染色體 Mb級工程性遺傳操作2. 克隆和擴增的宿主 基因工程：細菌（大腸桿菌、枯草芽胞桿菌）、真菌（酵母）、動植物細胞（昆蟲細胞、哺乳類細胞）基因組工程：可以細菌、真菌、動植物細胞為宿主，但主要以酵母和哺乳類培養(yǎng)細胞為主3. 工程性遺傳操作手段4. 產物檢測基因工程：限制性酶切圖譜、southern雜交、n

13、orthern雜交、PCR等分析基因表達情況，蛋白分析、酶學分析、免疫分析等研究其表達產物基因組工程：高通量手段，如生物芯片編輯ppt二二. 基因組工程研究中的遺傳同源重組系統(tǒng)基因組工程研究中的遺傳同源重組系統(tǒng)1. 基于Cre-loxP重組系統(tǒng)的基因組工程重組酶：Cre重組位點：loxPCre介導：同向loxP切除中間部分反向loxP導致倒位編輯ppt2. 基于Red/ET重組系統(tǒng)的基因組工程重組酶：Red、Red、Red或或Rede、RedT重組位點：短同源臂短同源臂（3550bp）編輯ppt3. TALEN靶向基因組編輯技術編輯ppt4. 基于Cas9核酸酶和sgRNA導向的CRISPR基因組編輯技術clustered regularly