原藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證

1、藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法建立1儀器與材料UV1601紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (日本島津)AB204-N電子天平 (萬(wàn)分之一天平，METTLER TOLEDO)BP211D電子天平 （十萬(wàn)分之一天平，Sarlorius）葡萄糖 (分析純，天津市化學(xué)試劑一廠)苯酚 (分析純，天津市化學(xué)試劑一廠)蒽酮 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）硫酸 (分析純，天津市凱信化學(xué)試劑有限公司)當(dāng)歸藥材購(gòu)于甘肅岷縣，經(jīng)天津藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部張鐵軍研究員鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv)Diels的干燥根，經(jīng)檢測(cè)符合中華人民共和國(guó)藥典（2010版）一部的有關(guān)規(guī)定。黃芪藥材購(gòu)于甘肅岷縣，經(jīng)天津

2、藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部張鐵軍研究員鑒定為蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch)BgeVarmongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，經(jīng)檢測(cè)符合中華人民共和國(guó)藥典（2010版）一部的有關(guān)規(guī)定。2方法與結(jié)果2.1藥材中多糖含量測(cè)定方法本試驗(yàn)采用比色法對(duì)藥材中的多糖含量進(jìn)行測(cè)定，并建立了含量測(cè)定方法。2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取105干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品30.43mg，置100ml量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml中含無(wú)水葡萄糖0.3043mg）。5苯酚試劑的配制 取苯酚100g，加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g，蒸

3、餾，收集182餾分，稱取此餾分5g置棕色容量瓶中溶解后定容，存冰箱備用。2.1.3 供試品溶液制備方法的考察與確定 水提時(shí)間的考察 分別取60干燥至恒重的當(dāng)歸及黃芪藥材細(xì)粉5份，每份約0.50g，精密稱定，置索氏提取器中，用80%乙醇回流提取2小時(shí)，殘?jiān)鼡]干溶劑后，再繼續(xù)以水分別回流提取1.0h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h，反復(fù)洗至250ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取1ml，置10ml具塞干燥試管中，采用改良后的苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1-1。表1-1 水提不同提取時(shí)間對(duì)當(dāng)歸含量測(cè)定的影響結(jié)果樣品提取時(shí)間（h）當(dāng)歸多糖含量（%）黃芪多糖含量（%）11.07

4、.5685.50122.08.5996.51133.08.5836.60044.08.5946.58955.08.5806.590從表1-1可知，水提提取時(shí)間為2.0h時(shí)，藥材含量達(dá)到最大值且保持恒定，延長(zhǎng)提取時(shí)間藥材含量變化不大，故選擇提取時(shí)間為2.0h。2.1.4 供試品溶液的制備 分別取60干燥至恒重的當(dāng)歸及黃芪藥材細(xì)粉約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，用80%乙醇回流提取1小時(shí)，殘?jiān)鼡]干溶劑后，再繼續(xù)以水回流提取2小時(shí)，反復(fù)洗滌殘?jiān)盁恐?50ml量瓶中，定容至刻度，搖勻，備用。 最大吸收波長(zhǎng)選擇 取2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在200nm-700nm波長(zhǎng)間進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，最

5、大吸收波長(zhǎng)為490nm，確定選擇490nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，6.0ml，分別置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述各溶液1ml，置具塞試管中，分別加5苯酚溶液0.6ml，混勻，迅速加入硫酸3.0ml，搖勻，于90水浴中15分鐘，取出，置冰水浴中15分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外可見(jiàn)分光光度法（附錄VA），在490nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1-2。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖取樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得回歸方程：y=0.0045x-0.0011，r=0.9995(n=6)

6、。葡萄糖在24.24145.44 g范圍內(nèi)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1-1。表1-2 葡萄糖線性范圍考察取樣量(g)吸光度24.240.11548.480.20972.720.33096.960.433121.200.554145.440.655圖1-1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1-1 Standard Curve of glucose 精密度試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作測(cè)吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，求得吸光度值的RSD值為0.33%。結(jié)果見(jiàn)表1-3，說(shuō)明儀器的精密度符合要求。表1-3 精密度試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定次數(shù)吸光度A10.38720.38630.38940.38850

7、.38660.386RSD（%）0.33 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作，每10分鐘測(cè)定一次吸光度，到1小時(shí)后改為30分鐘測(cè)一次，求得多糖含量的RSD值為1.02，結(jié)果見(jiàn)表1-4，測(cè)定值在120分鐘內(nèi)保持穩(wěn)定。以下吸光度的測(cè)定均在120分鐘內(nèi)完成。表1-4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定時(shí)間(min)多糖含量（）08.491108.380208.602308.447408.647508.624608.536908.4911208.513RSD（%）1.02 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取60按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作分別測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，求得多糖含量值RSD值為1.68，結(jié)果見(jiàn)表1-5，表

8、明方法重現(xiàn)性良好。表1-5 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果樣品多糖含量（%）18.71028.89538.50548.60258.60968.519平均含量8.640RSD（%）1.68 加樣回收率試驗(yàn) 取上述已知多糖含量的當(dāng)歸藥材細(xì)粉6份，每份約0.125g，精密稱定，精密加入濃度為2.111 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖對(duì)照品溶液5 ml按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作分別測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1-6。平均回收率為99.12%，RSD值1.96%。結(jié)果表明：本法回收率較好，方法可行。表1-6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果樣品取樣量（g）樣品含量（mg）對(duì)照品加入量（mg）實(shí)測(cè)量（mg）回收率（）平均回收率（）

9、RSD（%）10.124210.7010.5620.9797.2520.125610.8210.5621.61102.1830.125710.8310.5621.3399.4399.121.9640.125410.8010.5621.2298.6750.125510.8110.5621.39100.1960.125010.7710.5621.0196.97 當(dāng)歸藥材中多糖含量測(cè)定 取60干燥至恒重的當(dāng)歸藥材細(xì)粉三份，每份約0.25g按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，求得當(dāng)歸藥材中平均多糖含量為8.58，結(jié)果見(jiàn)表1-7。表1-7 當(dāng)歸藥材中多糖含量測(cè)定結(jié)果樣品取樣量（g）多糖含量（

10、）平均多糖含量（）10.25018.4420.24988.548.5830.25008.762.2 黃芪藥材中多糖含量測(cè)定方法本試驗(yàn)采用比色法對(duì)藥材中的含量進(jìn)行測(cè)定，建立了含量測(cè)定方法。2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)105干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.03260g，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每1ml中含無(wú)水葡萄糖0.3260mg）。 稱取蒽酮粉末0.2g，置100ml棕色量瓶中，加硫酸至刻度，搖勻，即得。2.2.3 供試品溶液的制備67 取黃芪藥材粗粉約1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100ml，加熱回流1.5h，用脫脂棉濾過(guò)，再重復(fù)提取2次，三次濾液

11、合并，濃縮，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取2 ml，置10ml具塞干燥試管中，備用。 供試品溶液制備方法的考察與確定 .1 加水量的考察 取黃芪藥材粗粉4份，每份約1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別加水50ml、100ml、150ml、200ml，加熱回流1h，用脫脂棉濾過(guò)，濾液濃縮，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取2 ml，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1-8和圖

12、1-2。表1-8 不同溶劑用量對(duì)含量測(cè)定的影響結(jié)果樣品加水量（ml）多糖含量（%）1504.81221007.87431507.70242007.774圖1-2不同溶劑用量對(duì)含量測(cè)定的影響結(jié)果從表1-8和圖1-2可知，加水量為100ml時(shí)，藥材含量達(dá)到最大值且保持恒定，故選擇加水量為100ml。.2 提取時(shí)間的考察 取黃芪藥材粗粉5份，每份約1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100ml，分別加熱回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，用脫脂棉濾過(guò)，濾液濃縮，移至100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀釋

13、至刻度，精密量取2 ml，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1-9和圖1-3。表1-9 不同提取時(shí)間對(duì)含量測(cè)定的影響結(jié)果樣品提取時(shí)間（h）多糖含量（%）10.57.59821.08.12531.58.59442.08.59752.58.585圖1-3 不同提取時(shí)間對(duì)含量測(cè)定的影響結(jié)果從表1-9和圖1-3可知，提取時(shí)間為1.5h時(shí)，藥材含量達(dá)到最大值且保持恒定，延長(zhǎng)提取時(shí)間藥材含量變化不大，故選擇提取時(shí)間為1.5h。.3 提取次數(shù)的選擇 取黃芪藥材粗粉5份，每份約1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水100mll，加熱回流1.5h，分別再重復(fù)提取0、1、2、3、4次，用脫脂棉濾過(guò)，濾液濃縮，移至100

14、ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取2 ml，加乙醇10 ml，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置25ml量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取2 ml，測(cè)定吸光度，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表1-10和圖1-4。表1-10 不同提取次數(shù)對(duì)含量測(cè)定的影響結(jié)果樣品提取次數(shù)（次）多糖含量（%）117.869228.7503310.130449.973559.702圖1-4 不同提取次數(shù)對(duì)含量測(cè)定的影響結(jié)果從表1-10和圖1-4可知，次數(shù)對(duì)多糖提取有影響，隨著次數(shù)增加多糖含量上升，提取次數(shù)為三次時(shí)，藥材含量達(dá)到最大值且保持恒定，增加提取次數(shù)藥材含量變化不大，故選擇提取次數(shù)為三次。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備66 精密量取對(duì)照品溶液

15、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分別置10ml具塞刻度試管中，各加水至2.0ml，搖勻，在冰水浴中緩緩滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度，混勻，放冷后置水浴中保溫10分鐘，取出，立即置冰水浴中冷卻10分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（附錄VA），在582nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1-11。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖取樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得回歸方程：y = 0.0041x + 0.0337，r=0.9992(n=6)。葡萄糖在32.60195.60 g范圍內(nèi)，與吸光度呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1-5。表1-11 葡萄糖線性范圍

16、考察取樣量(g)吸光度A32.600.15865.200.31297.800.426130.400.573163.000.685195.600.833圖1-5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密度試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作測(cè)吸光度，重復(fù)測(cè)定6次，求得吸光度值的RSD值為0.14%。結(jié)果見(jiàn)表1-12，說(shuō)明儀器的精密度符合要求。表1-12 精密度試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定次數(shù)吸光度A10.75420.75330.75340.75350.75260.755RSD（%）0.14穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作，每10分鐘測(cè)定一次吸光度，到1小時(shí)后改為30分鐘測(cè)一次，求得多糖含量

17、的RSD值為1.17，結(jié)果見(jiàn)表1-13，測(cè)定值在120分鐘內(nèi)保持穩(wěn)定。以下吸光度的測(cè)定均在120分鐘內(nèi)完成。表1-13 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果測(cè)定時(shí)間(min)多糖含量（）010.841010.722010.743011.124010.985011.016010.959010.9312010.92RSD（%）1.17 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取黃芪按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作分別測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，求得多糖含量值RSD值為1.14，結(jié)果見(jiàn)表1-14，表明方法重現(xiàn)性良好。表1-14 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果樣品多糖含量（%）110.77211.02310.93411.12510.97611.08平均含量10.98RSD（%）1.14 加樣回收率試驗(yàn) 取上述已知多糖含量的黃芪藥材粗粉6份，每份約0.5g，精密稱定，精密加入濃度為10.978mg/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖對(duì)照品溶液5 ml按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法操作分別測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1-15。平均回收率為99.61% ，RSD值1.73%。結(jié)果表明：本法回收率較好，方法可行。表1-15 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果樣品取樣量（g）樣品含量（mg）對(duì)照品加入量（mg）實(shí)測(cè)量（mg）回收率（）平均回收率（）RSD（%）10.499954.8954.89109.6599.7620.500554.9554.89110.18100.6230.