雙色熒光原位雜交檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的bcrabl融合基因

1、    雙色熒光原位雜交檢測(cè)慢性粒細(xì)胞白血病的 bcr/abl融合基因        自1984年發(fā)現(xiàn)了慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)具有bcr/abl融合基因1，2，檢測(cè)bcr/abl融合基因就成為診斷CML的關(guān)鍵。Tkachuk等3使用間接標(biāo)記的熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術(shù)檢測(cè)bcr/abl融合基因。應(yīng)用FISH技術(shù)比逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reve

2、rse transcript polymerase chain reaction,RT-PCR)及細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)更加可靠和靈敏地檢測(cè)出CML和部分急性淋巴細(xì)胞白血病患者的bcr/abl融合基因4，5。我們應(yīng)用雙色熒光原位雜交(dual-color FISH，D-FISH)技術(shù)，檢測(cè)15例CML患者的骨髓染色體標(biāo)本和骨髓涂片bcr/abl融合基因。 1對(duì)象和方法1.1對(duì)象(1)病例組：CML的臨床診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)6進(jìn)行。Ph染色體陽性的CML病例共15例，其中，男性13例，女性2例，年齡2063歲，平均39±13歲。各病例的骨髓染色體檢查結(jié)果見表1。(2)陰性對(duì)照組：7例，平均年

3、齡為40±14歲，與病例組年齡無顯著差異(P0.05)。其中，正常人2名，另外5例分別為早幼粒細(xì)胞白血病、急性粒-單核細(xì)胞白血病、全血細(xì)胞減少、繼發(fā)性粒細(xì)胞減少、惡性淋巴瘤患者，細(xì)胞遺傳學(xué)檢查無Ph染色體及其它染色體畸變。(3)材料：15例采用骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本，其中3例還采用了骨髓涂片標(biāo)本。兩名正常人取外周血染色體標(biāo)本進(jìn)行雜交檢測(cè)。表1實(shí)驗(yàn)組15例CML的細(xì)胞遺傳學(xué)和D-FISH資料例號(hào)性別骨髓細(xì)胞核型例數(shù)D-FISH涂片*染色體113男46，XY，t(9;22)131321415女46，XX，t(9;22)221合計(jì)-1515/153/3*僅有3例患者做了骨髓涂片檢查 1.2方法

4、1.2.1標(biāo)本處理(1)骨髓染色體制備：無菌條件下抽取骨髓0.50.8ml，分成兩份放入含有20%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37進(jìn)行短期培養(yǎng)。其中一瓶培養(yǎng)2小時(shí)后收獲細(xì)胞，另一瓶則進(jìn)行同步化短期培養(yǎng)，次日收獲。制片和染色體顯帶方法按常規(guī)進(jìn)行。(2)骨髓涂片：骨髓1滴，涂在載玻片中央(稍微涂厚)，晾干后用甲醇冰乙酸(31)固定5分鐘再晾干，然后用0.025%胰蛋白酶(1/15 mol/L PBS,pH7.0，37)消化5分鐘，再固定5分鐘后晾干備用。1.2.2融合基因探針美國(guó)VYSIS公司提供，bcr基因探針長(zhǎng)度約為300kb，覆蓋22號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)側(cè)端(3端)自第13外顯子至近著絲粒端(

5、5端)包括m-bcr的區(qū)域，用異硫氰熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)直接標(biāo)記。abl基因探針長(zhǎng)度約200kb，覆蓋9號(hào)染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)側(cè)端abl基因第5外顯子至端粒的區(qū)域，用羅達(dá)明(rhodamine)直接標(biāo)記7。1.2.3FISH操作步驟將玻片標(biāo)本浸入73 70%甲酰胺溶液中變性5分鐘，取出立即置入預(yù)冷在-20的70%乙醇中固定2分鐘，再經(jīng)乙醇系列脫水，空氣干燥備用。取abl基因探針和bcr基因探針混合物(美國(guó)VYSIS公司)1l與雜交緩沖液9l混合，置73水浴中變性5分鐘，然后滴至預(yù)溫在45的待雜交玻片上，蓋上蓋玻片，用橡膠水封片，置于37密閉濕盒內(nèi)雜交

6、1620小時(shí)，揭下蓋玻片，依次浸入45 50%甲酰胺漂洗2次，每次10分鐘，再分別經(jīng)45 2×SSC漂洗10分鐘，45 2×SSC/0.1%Np-40漂洗10分鐘，避光空氣干燥3060分鐘，用0.01%(w/w)二氨基酚吲哚(DAPI)復(fù)染，蓋上蓋玻片，橡膠水封片。用Olympus BX60熒光顯微鏡檢查雜交結(jié)果，用Olympus PM30顯微照相機(jī)多重曝光分別記錄兩種探針在同一個(gè)間期細(xì)胞或中期分裂相中所發(fā)出的熒光信號(hào)。2結(jié)果2.1對(duì)照組7例的雜交結(jié)果全部為陰性。在正常細(xì)胞內(nèi)，bcr基因和abl基因以等位基因形式存在，即2個(gè)abl基因分別在2個(gè)9號(hào)染色體的長(zhǎng)臂末端，2個(gè)bc

7、r基因分別在2個(gè)22號(hào)染色體的長(zhǎng)臂末端，互相不發(fā)生融合。而在間期細(xì)胞核內(nèi)，4個(gè)雜交信號(hào)(2紅2綠)互相不融合，見1。1正常細(xì)胞內(nèi)的bcr基因和abl基因細(xì)胞核內(nèi)可見：紅色熒光點(diǎn)為abl基因()，綠色熒光點(diǎn)為bcr基因(?)2.2病例組15例CML患者的雜交結(jié)果全部為融合基因陽性，與臨床診斷符合率為100%(15/15)，見表1。在間期核中分別觀察到2個(gè)紅色熒光點(diǎn)與2個(gè)綠色熒光點(diǎn)，當(dāng)其中1個(gè)紅色熒光點(diǎn)與1個(gè)綠色熒光點(diǎn)重疊或融合在一起時(shí)，即可判為1個(gè)bcr/abl融合基因，見2。被探針雜交上的中期分裂相中，可清楚地看到9號(hào)染色體的長(zhǎng)臂末端分別發(fā)出紅色亮點(diǎn)(abl探針)，22號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上也清楚地

8、顯現(xiàn)綠色亮點(diǎn)(bcr探針)，而Ph染色體上同時(shí)顯現(xiàn)出相連的紅色亮點(diǎn)和綠色亮點(diǎn)，證明bcr/abl融合基因存在于Ph染色體上。并且，abl基因是從Ph染色體的遠(yuǎn)側(cè)端與bcr基因融合的，見3。2有bcr/abl融合基因的白血病細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)可見：紅色熒光點(diǎn)為abl基因()，綠色熒光點(diǎn)為bcr基因(?)，紅綠色(黃色)為bcr/abl融合基因(?)3bcr/abl融合基因9號(hào)染色體上的紅色熒光點(diǎn)為abl基因()，22號(hào)染色體上的綠色熒光點(diǎn)為bcr基因(?)，Ph染色體上的紅綠色為bcr/abl融合基因(?)3討論應(yīng)用D-FISH技術(shù)可以對(duì)CML及部分急性淋巴細(xì)胞白血病患者的骨髓細(xì)胞中期分裂相和骨髓涂片

9、進(jìn)行bcr/abl融合基因檢測(cè)4，5。我們用此技術(shù)檢測(cè)15例Ph染色體陽性CML患者中bcr/abl融合基因，檢出率為100%，而陰性對(duì)照組的檢出率為0，說明此法對(duì)檢測(cè)bcr/abl融合基因具有很高的特異性和可靠性。實(shí)驗(yàn)顯示abl基因從Ph染色體遠(yuǎn)側(cè)端與bcr基因發(fā)生融合(3)。在同時(shí)做了骨髓細(xì)胞中期分裂相和骨髓涂片bcr/abl融合基因檢測(cè)的3個(gè)病例中，兩種材料所得的檢查結(jié)果一致。證明D-FISH技術(shù)可方便地從骨髓涂片中檢出bcr/abl融合基因，應(yīng)能成為臨床上診斷CML的常規(guī)檢查項(xiàng)目。本項(xiàng)目受云南省自然科學(xué)基金青年基金(94C038Q)資助作者單位：朱寶生李春華李永剛馮懷英王瑞紅（6500

10、32昆明，云南省第一人民醫(yī)院計(jì)劃生育科細(xì)胞遺傳室）沈曉梅史克倩賴洵（血液科）*為通信聯(lián)系人參考文獻(xiàn)1Groffen J,Stephenson JR,Heisterkamp N,et al.Philadelphia chromosomal breakpoints are clustered within a limited region, bcr,on chromosome 22.Cell,1984,36(1)93-99.2Shtivelman E, Lifshitz B, Gale RP,et al.Fused transcript of abl and bcr genes in chroni

11、c myelogenous leukemia. Nature,1985,315(6020)550-554.3Tkachuk DC, Gray J, Pinkel D, et al.Detection of bcr/abl fusion in chronic myelogeneous leukemia by in situ hybridization. Science,1990,250(4980)559-562.4Tbakhi A, Pettay J, Sreenan JJ,et al.Comparative analysis of interphase FISH and RT-PCR to detect bcr-abl translocation in chronic myelogenous leukemia and related disorders. Am J Clin Pathol,1998,109(1)16-23.5Cox MC,Maffei L, Buffolino S,et al.A comparative analysis of FISH,RT-PCR,and cytogenetics for the diagnosis of bcr-abl-positive leukemias. Am J Clin