半薄SDS-PAGE垂直式平板電泳法檢測尿蛋白譜

1、    半薄SDS-PAGE垂直式平板電泳法檢測尿蛋白譜        關(guān)鍵詞SDS-PAGE蛋白尿尿蛋白譜 蛋白尿是腎臟疾患的重要癥狀之一，其中蛋白的性質(zhì)與構(gòu)成（即尿蛋白譜）在診斷腎臟疾病及評估藥物療效等方面有著重要的參考價值。以往采用的蛋白電泳技術(shù)，如醋酸纖維薄膜、瓊脂糖凝膠、免疫電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、等電聚集以及SDS-PAGE圓盤電泳等方法雖各具優(yōu)點(diǎn)，但與臨床診斷所需的大量尿標(biāo)本檢測，以及蛋白成分高分辨率要求相比還存在著差距。本文介紹的半薄SDS-PA

2、GE垂直式平板電泳2，3，并結(jié)合高敏銀染4和激光密度掃描的方法，能夠快速有效地分析尿液中蛋白質(zhì)成分。1材料和方法11材料111儀器垂直式平板電泳槽（北京崇文東方儀器廠），激光密度掃描儀（MolecularDynamics公司，美國），直流電穩(wěn)壓輸出電源（Phamacia公司，美國）。112試劑中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（上海分子生物學(xué)研究所）；30PAGE凝膠貯液（丙烯酰胺29g，甲叉雙丙烯酰胺1g）；10十二烷基硫代硫酸鈉（SDS）；20過硫酸銨；三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）緩沖液（pH 8.9）；Tris-HCl緩沖液（pH 6.7）；四甲基乙二胺（TEMED）；Tris-甘氨酸電泳

3、緩沖液（pH 8.3）。所有試劑均為分析純。113標(biāo)本尿標(biāo)本分別來自留取的健康成人和腎臟疾病患者50ml新鮮晨尿。12方法和步驟121凝膠的配制分別配制12分離膠和4的濃縮膠，其方法簡述如下。取Tris-HCl緩沖液（pH 8.9）2.5ml，凝膠貯液8ml，10SDS溶液200l，及雙蒸水9ml，再加入TEMED20l和20過硫酸銨200l，充分混勻后即為12的分離膠。另取Tris-HCl緩沖液（pH 6.7）1.25ml，凝膠貯液1.3ml，10SDS溶液100l，及雙蒸水7.26ml，再加入TEMED 10l和20過硫酸銨50l，充分混勻后即為4的濃縮膠。按實(shí)驗(yàn)要求分別將分離膠和濃縮膠依

4、次加入1mm的垂直電泳板中即可。122電泳晨尿標(biāo)本先進(jìn)行蛋白定性，根據(jù)蛋白定性的結(jié)果決定樣本電泳所需的上樣量，如附表所示。加樣后在110伏電壓下電泳56 h。以溴酚藍(lán)做為電泳指示劑。附表尿蛋白定性檢測結(jié)果與電泳上樣量的關(guān)系蛋白定性結(jié)果取樣量（l）或±2010521     123銀染電泳結(jié)束后，用雙蒸水配制的固定液（30乙醇，10乙酸）固定6h以上。隨后以30乙醇漂洗兩次，每次漂洗時間不應(yīng)少于10min。純水清洗兩次（10min）后，加入0.01AgNO3染液染色45min。顯色液（25Na2CO3、0.05甲醛）顯色后用1乙酸終止反應(yīng)。124

5、掃描將處理好的凝膠上機(jī)進(jìn)行激光掃描，在相應(yīng)軟件支持下，計算可得各組分蛋白的分子量及其百分含量。2結(jié)果本方法所得蛋白電泳條帶清晰可辯，能夠明顯區(qū)分尿標(biāo)本中不同分子量的蛋白組分（見附A）。借助密度掃描儀可分析尿標(biāo)本中不同分子量蛋白含量。B是激光密度掃描泳道3電泳條帶的密度掃描。附表是根據(jù)泳道3密度掃描而得到的該患者尿液中不同分子量蛋白的組成。附表某患者尿液中不同分子量蛋白譜姓名蔣××年齡25F診斷IgAN種類分子量百分比蛋白帶數(shù)高分子731.1615白蛋白6萬7萬23.616，7低分子4萬6萬7.328，9低分子2萬4萬22.301017低分子6千2萬15.611824低分子6

6、千     3討論本研究采用半薄SDS-PAGE垂直式平板電泳法分析尿標(biāo)本中蛋白質(zhì)的組分，重復(fù)性較好。同一塊凝膠板能夠?qū)Χ鄠€患者的尿標(biāo)本進(jìn)行電泳分析，便于多樣本的臨床檢測，有助于腎臟病的診斷與治療效果的評判。半薄SDS-PAGE垂直式平板電泳法的儀器設(shè)備簡單，試劑易于配制，技術(shù)操作不難，所得結(jié)果直觀，便于分析判斷。與圓盤電泳相比，本方法操作步驟簡單。由于采用厚度為1mm的普通凝膠板，易于掃描時光線透過，提高電泳條帶的識別分辨能力。同時縮短了檢測時間，整個檢測過程不超過一天半；染色采取銀染，時間快速，條帶的清晰度優(yōu)于G-250染色。根據(jù)尿蛋白的來源可將其分

7、為腎小球性、腎小管性以及混合性蛋白尿；而腎小球?yàn)V過蛋白質(zhì)的大小又可將其分為選擇性和非選擇性蛋白尿。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，尿液中的蛋白成分可能參與了腎小管及間質(zhì)的損傷1。正常人尿液中蛋白含量極微，其尿蛋白譜特征為白蛋白含量約為40左右，高分子量和小分子量蛋白含量少。病理情況下，尿蛋白陽性，尿蛋白譜也發(fā)生相應(yīng)的改變，諸如蛋白成份增多，一些蛋白的含量發(fā)生變化等。腎病綜合征患者尿蛋白譜最明顯的特征就是高分子量蛋白和白蛋白的含量增加，高分子量蛋白的種類增多；腎間質(zhì)病變最明顯的變化是小分子量蛋白條帶增多和百分含量增加；大部分糖尿病患者出現(xiàn)蛋白尿時，其尿蛋白譜明顯的變化是白蛋白含量大幅度升高；其它腎臟疾病，尿蛋

8、白譜也有其相應(yīng)的特點(diǎn)。另外，在治療過程中，尿蛋白譜也會發(fā)生改變58，如附A所示，泳道1為蛋白標(biāo)準(zhǔn)，其余泳道均為腎病患者晨尿標(biāo)本。泳道7、8、9中小分子蛋白比例增加很明顯，泳道5、6的大分子蛋白比例增加，而泳道2、3顯示除了大分子蛋白增加外，小分子蛋白組分增多且量也增加。尿蛋白譜中蛋白組分質(zhì)和量的變化，可以作為判斷腎病患者腎小球和腎小管受損程度的參考依據(jù)。腎間質(zhì)有損害時，可利用半薄SDS-PAGE快速檢測出對腎間質(zhì)有致?lián)p作用的蛋白質(zhì)及其含量；另外，尿液中有些蛋白質(zhì)可作為腎病的預(yù)后指標(biāo)，如多聚白蛋白（PA），可通過半薄SDS-PAGE結(jié)合膜轉(zhuǎn)印免疫雜交技術(shù)，檢測尿液中PA的出現(xiàn)及其百分含量9。防止

9、發(fā)生污染是進(jìn)行尿蛋白分析的重要條件之一。本方法在配制凝膠過程中需使用雙蒸水，并使用一次性塑料手套，以保證電泳結(jié)果染色的背景清晰度。過硫酸銨需優(yōu)級純并且新鮮配制，否則影響凝膠的聚合速度和程度。電泳步驟中需注意樣品的上樣量，否則銀染色后白蛋白部位會出現(xiàn)半透明的“大肚子”，掃描時使白蛋白的百分比下降，給臨床錯誤的參考指標(biāo)。銀染具有安全、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，染色試劑最好為優(yōu)級純，且要用去離子水新鮮配制，顯影液預(yù)冷、顯影時間加長、顯影過程中多次更換顯影液可使背景降低，條帶清晰。聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度決定凝膠孔徑的大小，影響蛋白的泳動速度和各蛋白組分間的距離，因而還需根據(jù)臨床的需要，配制不同濃度的凝膠，對

10、蛋白組分進(jìn)行更細(xì)的分析。作者單位：南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍腎臟病研究所（南京，210002）參考文獻(xiàn)1 Chen L，Wang Y，Tay YC et alProteinuria and tubulointerstitial injuryKidney Int，1997，61（suppl）：S602 Bianchi-Bosisio A，Gaboardi F，Gianazza E et alSodium dodecyl sulphateelectrophoresis of urinary proteinsJ Chromatogr，1991，569：2433 Stierle HE，Oser B，Bo

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