哮喘豚鼠肺組織嗜酸性粒細胞Fas表達及藥物的影響

1、哮喘豚鼠肺組織嗜酸性粒細胞Fas表達及藥物的影響提要目的：研究哮喘時嗜酸性粒細胞(Eos)凋亡與Fas表達的關系及藥物對它們的影響。方法：應用地塞米松(DM)、雷公藤甲素(Triptolide,TP)及氨茶堿(AM)干預哮喘豚鼠，以TUNEL法檢測細胞凋亡，以RT-PCR及原位雜交檢測Fas mRNA表達。結果：哮喘組Eos凋亡率較正常對照組顯著降低(P0.01)，應用DM、TP、AM后均顯著增加(P0.05)。哮喘組Fas mRNA明顯減少，以低密度Eos減少明顯(P0.05)，應用DM、TP、AM后其表達明顯增加。結論：凋亡調節(jié)的缺失是導致組織及血中Eos增多的重要原因，F(xiàn)as抗原參與了哮

2、喘Eos凋亡的調節(jié)，低密度Eos更能反映哮喘的特征。DM、TP、AM可促進哮喘肺組織中的Eos表達Fas抗原，進而加強細胞凋亡。關鍵詞哮喘；嗜酸細胞；細胞凋亡；Fas中圖法分類號R329.25;R562.25Fas expression on eosinophils in lungs and its changes after treatment in asthmatic guinea pigs?AbstractObjective: To determine the relationship between the apoptosis of asthmatic eosinophils and

3、Fas expression and its changes after treated with drugs. Methods: After the asthmatic guinea pigs were treated with dexamethasone (DM), triptolide (TP) and aminophylline (AM), apoptosis of the eosinophils was detected by TdT-mediated dUTP nick end labeling and Fas mRNA expression measured by RT-PCR

4、and in situ hybridization. Results: The number of the apoptotic eosinophils was significantly lower in asthmatic group than in the control (P0.01) and markedly increased after treated with DM, TP and AM (P0.01). Fas mRNA of the eosinophils was moderately expressed in normal guinea pigs, decreased in

5、 asthmatic ones and significantly increased after treatment with the 3 agents (P0.05). Conclusion: Fas may be one of the important factors regulating apoptosis of eosinophils in asthma. DM, TP and AM can up-regulate the Fas expression to promote apoptosis of eosinophils in the lungs of guinea pigs a

6、fter asthma.Key wordsasthma; eosinophil; apoptosis; Fas; guinea pig哮喘是一非特異的慢性炎癥性疾病，嗜酸性粒細胞(Eosinophils,Eos)聚集、活化及其高毒性陽離子蛋白的釋放在其發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用。以往人們注意到Eos的 滲出依賴IL-5，但對Eos炎癥反應的控制研究很少。不斷有證據(jù)表明細胞死亡是由細胞凋亡引起，對炎癥反應清除很重要。近來發(fā)現(xiàn)Eos凋亡減少是哮喘Eos增加的重要原因之一。在體外，Eos存活依賴抑制凋亡的細胞因子白介素(Interleukin,IL)-3、IL-5、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Gra

7、nulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)，是否存在促進Eos凋亡的因素仍不很清。細胞表面分子Fas/apo-1(CD95)被認為是一促凋亡基因，能促進多種細胞凋亡。Fas是一45103u蛋白，屬于TNF/NGF受體家族成員。Fas受體與其單抗或其配體交叉連接可致淋巴細胞凋亡。本實驗用地塞米松、雷公藤甲素及氨茶堿干預，觀察哮喘肺組織Eos Fas表達與細胞凋亡及細胞凋亡與炎癥清除的關系。1材料與方法1.1主要試劑原位細胞凋亡檢測試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit,POD)，購自德國Boehri

8、nger Mannheim (BM)公司?？俁NA提取試劑盒(Tripure Isolation Regent)，德國BM公司。寡核苷酸探針3末端標記試劑盒(Dig Oligonucleotide 3-end Labeling Kit)，德國BM公司 。Percoll分離液，瑞典Phamacia公司。M-MLV逆轉轉錄酶，美國Promega公司。Taq DNA多聚酶，加拿大Sango公司。Oligo dT(15)，美國Promega公司。dNTP，德國BM公司。抗地高辛(Dig)抗體，德國BM公司。1.2動物分組健康豚鼠30只,購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，體重200250 g，雌雄不拘，隨機

9、分為5組(每組6只)：正常對照組、哮喘組、地塞米松(DM)組、雷公藤甲素(Triptolide,TP)組及氨茶堿(AM)組。哮喘動物模型制備參照王長征1略加修改。在第1天和第8天，將2%卵蛋白(OA，溶于生理鹽水)與等量的氫氧化鋁凝膠混勻后，豚鼠腹腔內注入0.5ml。在第21天，將豚鼠置密閉容器內，2%OA氣霧進行激發(fā)，把動物暴露在OA中至哮喘發(fā)作30min為止。激發(fā)前30min給予腹腔注射苯海拉明5mg/kg，防止豚鼠嚴重哮喘發(fā)作而死亡。48h后行支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage,BAL)。正常組：按哮喘組方法，用苯海拉明預處理動物后，用生理鹽水代替2%OA進行激

10、發(fā)，48h后行BAL。各處理組：按哮喘組方法處理動物。用卵蛋白激發(fā)24h后，用地塞米松10mg/kg或雷公藤甲素40g/kg或氨茶堿100mg/kg豚鼠腹腔注射，24h后行BAL。1.3主要方法Fas：同義鏈：5-CAA GGG ACT GAT AGC ATC TTT GAG G-3反義鏈：5-TGT GAA AGT CCA GAA CCC TAA GG-3-actin：同義鏈：5-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3反義鏈：5-AGG GTA CAT GTG GTG CCG CCA GA-31.4統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)以SPSS(Statistics packa

11、ge for social science)統(tǒng)計學分析。各組結果以s表示，采用非配對t檢驗。2結果2.1DM、TP、AM對哮喘豚鼠Eos細胞凋亡的影響哮喘組Eos凋亡率較正常對照組明顯降低(P0.01)，應用DM、TP、AM后均顯著增加(P0.05)，見表1。表 1DM、TP、AM對哮喘豚鼠BALF中Eos細胞凋亡的作用(%，n=6，s)Tab 1Effects of DM,TP and AM on the apoptosis of eosinophils in BALF of asthmatic guinea pig(%，n=6，s)Normal Asthma Dexamethasone T

12、riptolide Aminophylline Hypodensity Eos 82 42# 245* 179* 155* Normal density Eos 72 32# 224* 168* 144*#：P0.01 vs normal；*：P0.05,*：P0.01 vs asthma2.2DM、TP、AM對哮喘豚鼠肺組織及BALF Eos Fas表達的影響原位雜交顯示：正常組可檢測到Fas mRNA表達，哮喘組明顯減少(P0.05),以低密度Eos明顯(P0.05)，應用DM、TP后其表達明顯增加(P0.05，P0.01)。AM可使低密度Eos Fas表達增強(P0.05)，見表2。2.

13、3DM、TP、AM對Eos Fas mRNA表達相對含量的影響RT-PCR檢測顯示：正常組Eos可檢測到Fas mRNA表達，哮喘組明顯減少(P0.05)，應用DM、TP、AM后其表達明顯增加，以低密度Eos明顯。AM組低密度Eos Fas表達增強(P0.05)，見表3。表 2DM、TP、AM對哮喘豚鼠肺BALF Eos Fas mRNA表達的影響原位雜交強陽性率(%)，n=6，sTab 2Effects of DM,TP and AM on Fas mRNA expression in eosinophils of asthmatic guinea pig BALF(%，n=6，s)Norm

14、al Asthma Dexamethasone Triptolide Aminophylline Hypodensity Eos 358 253# 375* 369* 368* Normal density Eos 436 337# 436* 438* 3717#：P0.05 vs normal;*：P0.05，*：P0.01 vs asthma表 3DM、TP、AM對Eos Fas mRNA表達相對含量的影響(IOD(Fas)/IOD(actin),n=6,s)Tab 3Effects of DM,TP and AM on Fas mRNA expression in eosinophils

15、 of asthmatic guinea pig BALF(IOD(Fas)/IOD(actin)，n=6,s)Normal Asthma Dexamethasone Triptolide Aminophyline Hypodensity Eos 2.090.14 1.250.11# 1.890.20* 1.690.21* 1.630.24* Normal density Eos 1.910.45 1.290.19# 1.890.24* 1.640.21* 1.600.39#：P0.05, #：P0.01 vs normal;*：P0.05，*：P0.01 vs asthma3討論嗜酸性粒細胞

16、在血中聚集及活化是許多過敏疾病的特征?；罨腅os細胞毒產物引起的細胞損傷，致組織炎癥，炎癥的清除一部分是通過巨噬細胞，它可完整吞噬凋亡細胞。炎癥細胞活動則通過選擇性加強它們自我損傷而加速在組織中的清除。最近Fas抗原研究給控制凋亡復雜網絡帶來一些希望。在多種細胞類型中起凋亡作用Fas(Apo-1/CD95)，是一種45103u的跨膜蛋白，與TNF-、CD40等同屬腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族。Fas可在胸腺細胞、T細胞、單核細胞、B細胞、質化細胞、上皮細胞及內皮細胞等多種細胞中表達。Fas抗原與它的天然配體(FasL)或其抗體結合后，誘導細胞內的酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸化以及引起細胞內

17、Ca2+濃度升高，促進細胞凋亡。這是一種Fas依賴的清除體內多余細胞的重要方式。在體外，F(xiàn)as配體及特異的單抗可致許多類型的細胞凋亡。最近發(fā)現(xiàn)Eos可表達低但恒定的Fas抗原水平。抗Fas單抗在體外應用可加速Eos凋亡，在體內可通過降低組織Eos炎癥治療鼻息肉3。本研究發(fā)現(xiàn)，正常豚鼠的Eos存在一定量的Fas mRNA表達，而在哮喘時Eos表達Fas明顯下降，同時細胞凋亡減少，表明Fas依賴的Eos凋亡是哮喘Eos的特征。不同密度的Eos細胞活性不同，低密度Eos具有高細胞活性，本研究結果顯示正常豚鼠肺中不同密度Eos Fas表達無差異，而哮喘組低密度Eos較正常密度Eos Fas表達明顯下降

18、，表明它是哮喘組織炎癥產生的主要原因，其調節(jié)凋亡的Fas通路在哮喘時受限更加明顯，同時對各種藥物反應也更敏感。是Eos炎癥及其清除的焦點。有研究表明抗Fas抗體在24 h內幾乎可完全緩解Eos肺炎4。凋亡細胞很快被巨噬細胞吞噬，并不引起第二次炎癥，更重要的是Fas介導的細胞死亡不能被外加IL-3、IL-5或GM-CSF救活。表明：Fas介導死亡不易被這類因子通過bcl-2信號救活，在嚴重的激素不敏感哮喘時，這些因子逃避了抑制，針對Fas的治療也許很有用。缺乏Fas介導的Eos死亡可能是哮喘時慢性氣道炎癥的重要因素4，5。糖皮質激素通過不同機制抑制炎癥細胞中細胞因子基因轉錄來降低組織中的炎癥，在

19、治療多種Eos相關疾病包括哮喘中有顯著作用。地塞米松能引起體內Eos顯著降低。雖然激素作用的確切機理仍需研究，體內外實驗均表明激素可促進凋亡的產生，本研究也證明了這一點。地塞米松結合Eos上的糖皮質激素受體，相互作用，加速凋亡，促進炎癥的清除6。Wallen等7發(fā)現(xiàn)IL-5、IL-3及GM-CSF介導的Eos存活可被皮質激素阻止。表明激素競爭性阻滯Eos活動性細胞因子的作用。激素調整Eos的死亡通過影響不同的凋亡信號，包括Fas抗原的活動8。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘豚鼠Eos Fas抗原表達下降，應用DM、TP、AM后，其Fas抗原表達增加，表明它們均可影響了Fas/FasL通路，促進細胞凋亡，利于肺組

20、織炎癥的清除，以DM明顯。AM也促進了Eos凋亡，與地塞米松組無明顯差異，但對Eos Fas的表達不如DM及TP強，表明其作用機制不完全一樣。其詳細機制有待進一步研究。凋亡調節(jié)的缺失是導致組織及血中Eos增多的重要原因，F(xiàn)as抗原也參與了哮喘豚鼠Eos凋亡的調節(jié)，DM、TP、AM可促進哮喘肺組織中的Eos表達Fas抗原，進而加強細胞凋亡。發(fā)現(xiàn)選擇性的促進Fas表達過程的制劑對清除炎癥及過敏反應具有誘人的前景。參考文獻3Hebestreit H, Yousefi S, Batti I, et al. Expression and function of the Fas receptor on human blood and tissue eosinophils. Eur J Immunol,1996,26(8):17754Tsuyuki S, Bertrand C, Erard F, et al.