哮喘豚鼠肺組織嗜酸性粒細(xì)胞Fas表達(dá)及藥物的影響

1、哮喘豚鼠肺組織嗜酸性粒細(xì)胞Fas表達(dá)及藥物的影響提要目的：研究哮喘時(shí)嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)凋亡與Fas表達(dá)的關(guān)系及藥物對(duì)它們的影響。方法：應(yīng)用地塞米松(DM)、雷公藤甲素(Triptolide,TP)及氨茶堿(AM)干預(yù)哮喘豚鼠，以TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，以RT-PCR及原位雜交檢測(cè)Fas mRNA表達(dá)。結(jié)果：哮喘組Eos凋亡率較正常對(duì)照組顯著降低(P0.01)，應(yīng)用DM、TP、AM后均顯著增加(P0.05)。哮喘組Fas mRNA明顯減少，以低密度Eos減少明顯(P0.05)，應(yīng)用DM、TP、AM后其表達(dá)明顯增加。結(jié)論：凋亡調(diào)節(jié)的缺失是導(dǎo)致組織及血中Eos增多的重要原因，F(xiàn)as抗原參與了哮

2、喘Eos凋亡的調(diào)節(jié)，低密度Eos更能反映哮喘的特征。DM、TP、AM可促進(jìn)哮喘肺組織中的Eos表達(dá)Fas抗原，進(jìn)而加強(qiáng)細(xì)胞凋亡。關(guān)鍵詞哮喘；嗜酸細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；Fas中圖法分類(lèi)號(hào)R329.25;R562.25Fas expression on eosinophils in lungs and its changes after treatment in asthmatic guinea pigs?AbstractObjective: To determine the relationship between the apoptosis of asthmatic eosinophils and

3、Fas expression and its changes after treated with drugs. Methods: After the asthmatic guinea pigs were treated with dexamethasone (DM), triptolide (TP) and aminophylline (AM), apoptosis of the eosinophils was detected by TdT-mediated dUTP nick end labeling and Fas mRNA expression measured by RT-PCR

4、and in situ hybridization. Results: The number of the apoptotic eosinophils was significantly lower in asthmatic group than in the control (P0.01) and markedly increased after treated with DM, TP and AM (P0.01). Fas mRNA of the eosinophils was moderately expressed in normal guinea pigs, decreased in

5、 asthmatic ones and significantly increased after treatment with the 3 agents (P0.05). Conclusion: Fas may be one of the important factors regulating apoptosis of eosinophils in asthma. DM, TP and AM can up-regulate the Fas expression to promote apoptosis of eosinophils in the lungs of guinea pigs a

6、fter asthma.Key wordsasthma; eosinophil; apoptosis; Fas; guinea pig哮喘是一非特異的慢性炎癥性疾病，嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils,Eos)聚集、活化及其高毒性陽(yáng)離子蛋白的釋放在其發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。以往人們注意到Eos的 滲出依賴(lài)IL-5，但對(duì)Eos炎癥反應(yīng)的控制研究很少。不斷有證據(jù)表明細(xì)胞死亡是由細(xì)胞凋亡引起，對(duì)炎癥反應(yīng)清除很重要。近來(lái)發(fā)現(xiàn)Eos凋亡減少是哮喘Eos增加的重要原因之一。在體外，Eos存活依賴(lài)抑制凋亡的細(xì)胞因子白介素(Interleukin,IL)-3、IL-5、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Gra

7、nulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)，是否存在促進(jìn)Eos凋亡的因素仍不很清。細(xì)胞表面分子Fas/apo-1(CD95)被認(rèn)為是一促凋亡基因，能促進(jìn)多種細(xì)胞凋亡。Fas是一45103u蛋白，屬于TNF/NGF受體家族成員。Fas受體與其單抗或其配體交叉連接可致淋巴細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用地塞米松、雷公藤甲素及氨茶堿干預(yù)，觀察哮喘肺組織Eos Fas表達(dá)與細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡與炎癥清除的關(guān)系。1材料與方法1.1主要試劑原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(In Situ Cell Death Detection Kit,POD)，購(gòu)自德國(guó)Boehri

8、nger Mannheim (BM)公司?？俁NA提取試劑盒(Tripure Isolation Regent)，德國(guó)BM公司。寡核苷酸探針3末端標(biāo)記試劑盒(Dig Oligonucleotide 3-end Labeling Kit)，德國(guó)BM公司 。Percoll分離液，瑞典Phamacia公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶，美國(guó)Promega公司。Taq DNA多聚酶，加拿大Sango公司。Oligo dT(15)，美國(guó)Promega公司。dNTP，德國(guó)BM公司?？沟馗咝?Dig)抗體，德國(guó)BM公司。1.2動(dòng)物分組健康豚鼠30只,購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重200250 g，雌雄不拘，隨機(jī)

9、分為5組(每組6只)：正常對(duì)照組、哮喘組、地塞米松(DM)組、雷公藤甲素(Triptolide,TP)組及氨茶堿(AM)組。哮喘動(dòng)物模型制備參照王長(zhǎng)征1略加修改。在第1天和第8天，將2%卵蛋白(OA，溶于生理鹽水)與等量的氫氧化鋁凝膠混勻后，豚鼠腹腔內(nèi)注入0.5ml。在第21天，將豚鼠置密閉容器內(nèi)，2%OA氣霧進(jìn)行激發(fā)，把動(dòng)物暴露在OA中至哮喘發(fā)作30min為止。激發(fā)前30min給予腹腔注射苯海拉明5mg/kg，防止豚鼠嚴(yán)重哮喘發(fā)作而死亡。48h后行支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage,BAL)。正常組：按哮喘組方法，用苯海拉明預(yù)處理動(dòng)物后，用生理鹽水代替2%OA進(jìn)行激

10、發(fā)，48h后行BAL。各處理組：按哮喘組方法處理動(dòng)物。用卵蛋白激發(fā)24h后，用地塞米松10mg/kg或雷公藤甲素40g/kg或氨茶堿100mg/kg豚鼠腹腔注射，24h后行BAL。1.3主要方法Fas：同義鏈：5-CAA GGG ACT GAT AGC ATC TTT GAG G-3反義鏈：5-TGT GAA AGT CCA GAA CCC TAA GG-3-actin：同義鏈：5-CCA AGG CCA ACC GCG AGA AGA TGA C-3反義鏈：5-AGG GTA CAT GTG GTG CCG CCA GA-31.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以SPSS(Statistics packa

11、ge for social science)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組結(jié)果以s表示，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1DM、TP、AM對(duì)哮喘豚鼠Eos細(xì)胞凋亡的影響哮喘組Eos凋亡率較正常對(duì)照組明顯降低(P0.01)，應(yīng)用DM、TP、AM后均顯著增加(P0.05)，見(jiàn)表1。表 1DM、TP、AM對(duì)哮喘豚鼠BALF中Eos細(xì)胞凋亡的作用(%，n=6，s)Tab 1Effects of DM,TP and AM on the apoptosis of eosinophils in BALF of asthmatic guinea pig(%，n=6，s)Normal Asthma Dexamethasone T

12、riptolide Aminophylline Hypodensity Eos 82 42# 245* 179* 155* Normal density Eos 72 32# 224* 168* 144*#：P0.01 vs normal；*：P0.05,*：P0.01 vs asthma2.2DM、TP、AM對(duì)哮喘豚鼠肺組織及BALF Eos Fas表達(dá)的影響原位雜交顯示：正常組可檢測(cè)到Fas mRNA表達(dá)，哮喘組明顯減少(P0.05),以低密度Eos明顯(P0.05)，應(yīng)用DM、TP后其表達(dá)明顯增加(P0.05，P0.01)。AM可使低密度Eos Fas表達(dá)增強(qiáng)(P0.05)，見(jiàn)表2。2.

13、3DM、TP、AM對(duì)Eos Fas mRNA表達(dá)相對(duì)含量的影響RT-PCR檢測(cè)顯示：正常組Eos可檢測(cè)到Fas mRNA表達(dá)，哮喘組明顯減少(P0.05)，應(yīng)用DM、TP、AM后其表達(dá)明顯增加，以低密度Eos明顯。AM組低密度Eos Fas表達(dá)增強(qiáng)(P0.05)，見(jiàn)表3。表 2DM、TP、AM對(duì)哮喘豚鼠肺BALF Eos Fas mRNA表達(dá)的影響原位雜交強(qiáng)陽(yáng)性率(%)，n=6，sTab 2Effects of DM,TP and AM on Fas mRNA expression in eosinophils of asthmatic guinea pig BALF(%，n=6，s)Norm

14、al Asthma Dexamethasone Triptolide Aminophylline Hypodensity Eos 358 253# 375* 369* 368* Normal density Eos 436 337# 436* 438* 3717#：P0.05 vs normal;*：P0.05，*：P0.01 vs asthma表 3DM、TP、AM對(duì)Eos Fas mRNA表達(dá)相對(duì)含量的影響(IOD(Fas)/IOD(actin),n=6,s)Tab 3Effects of DM,TP and AM on Fas mRNA expression in eosinophils

15、 of asthmatic guinea pig BALF(IOD(Fas)/IOD(actin)，n=6,s)Normal Asthma Dexamethasone Triptolide Aminophyline Hypodensity Eos 2.090.14 1.250.11# 1.890.20* 1.690.21* 1.630.24* Normal density Eos 1.910.45 1.290.19# 1.890.24* 1.640.21* 1.600.39#：P0.05, #：P0.01 vs normal;*：P0.05，*：P0.01 vs asthma3討論嗜酸性粒細(xì)胞

16、在血中聚集及活化是許多過(guò)敏疾病的特征。活化的Eos細(xì)胞毒產(chǎn)物引起的細(xì)胞損傷，致組織炎癥，炎癥的清除一部分是通過(guò)巨噬細(xì)胞，它可完整吞噬凋亡細(xì)胞。炎癥細(xì)胞活動(dòng)則通過(guò)選擇性加強(qiáng)它們自我損傷而加速在組織中的清除。最近Fas抗原研究給控制凋亡復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)帶來(lái)一些希望。在多種細(xì)胞類(lèi)型中起凋亡作用Fas(Apo-1/CD95)，是一種45103u的跨膜蛋白，與TNF-、CD40等同屬腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族。Fas可在胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、質(zhì)化細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中表達(dá)。Fas抗原與它的天然配體(FasL)或其抗體結(jié)合后，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸化以及引起細(xì)胞內(nèi)

17、Ca2+濃度升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這是一種Fas依賴(lài)的清除體內(nèi)多余細(xì)胞的重要方式。在體外，F(xiàn)as配體及特異的單抗可致許多類(lèi)型的細(xì)胞凋亡。最近發(fā)現(xiàn)Eos可表達(dá)低但恒定的Fas抗原水平?？笷as單抗在體外應(yīng)用可加速Eos凋亡，在體內(nèi)可通過(guò)降低組織Eos炎癥治療鼻息肉3。本研究發(fā)現(xiàn)，正常豚鼠的Eos存在一定量的Fas mRNA表達(dá)，而在哮喘時(shí)Eos表達(dá)Fas明顯下降，同時(shí)細(xì)胞凋亡減少，表明Fas依賴(lài)的Eos凋亡是哮喘Eos的特征。不同密度的Eos細(xì)胞活性不同，低密度Eos具有高細(xì)胞活性，本研究結(jié)果顯示正常豚鼠肺中不同密度Eos Fas表達(dá)無(wú)差異，而哮喘組低密度Eos較正常密度Eos Fas表達(dá)明顯下降

18、，表明它是哮喘組織炎癥產(chǎn)生的主要原因，其調(diào)節(jié)凋亡的Fas通路在哮喘時(shí)受限更加明顯，同時(shí)對(duì)各種藥物反應(yīng)也更敏感。是Eos炎癥及其清除的焦點(diǎn)。有研究表明抗Fas抗體在24 h內(nèi)幾乎可完全緩解Eos肺炎4。凋亡細(xì)胞很快被巨噬細(xì)胞吞噬，并不引起第二次炎癥，更重要的是Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡不能被外加IL-3、IL-5或GM-CSF救活。表明：Fas介導(dǎo)死亡不易被這類(lèi)因子通過(guò)bcl-2信號(hào)救活，在嚴(yán)重的激素不敏感哮喘時(shí)，這些因子逃避了抑制，針對(duì)Fas的治療也許很有用。缺乏Fas介導(dǎo)的Eos死亡可能是哮喘時(shí)慢性氣道炎癥的重要因素4，5。糖皮質(zhì)激素通過(guò)不同機(jī)制抑制炎癥細(xì)胞中細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄來(lái)降低組織中的炎癥，在

19、治療多種Eos相關(guān)疾病包括哮喘中有顯著作用。地塞米松能引起體內(nèi)Eos顯著降低。雖然激素作用的確切機(jī)理仍需研究，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明激素可促進(jìn)凋亡的產(chǎn)生，本研究也證明了這一點(diǎn)。地塞米松結(jié)合Eos上的糖皮質(zhì)激素受體，相互作用，加速凋亡，促進(jìn)炎癥的清除6。Wallen等7發(fā)現(xiàn)IL-5、IL-3及GM-CSF介導(dǎo)的Eos存活可被皮質(zhì)激素阻止。表明激素競(jìng)爭(zhēng)性阻滯Eos活動(dòng)性細(xì)胞因子的作用。激素調(diào)整Eos的死亡通過(guò)影響不同的凋亡信號(hào)，包括Fas抗原的活動(dòng)8。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘豚鼠Eos Fas抗原表達(dá)下降，應(yīng)用DM、TP、AM后，其Fas抗原表達(dá)增加，表明它們均可影響了Fas/FasL通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，利于肺組

20、織炎癥的清除，以DM明顯。AM也促進(jìn)了Eos凋亡，與地塞米松組無(wú)明顯差異，但對(duì)Eos Fas的表達(dá)不如DM及TP強(qiáng)，表明其作用機(jī)制不完全一樣。其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。凋亡調(diào)節(jié)的缺失是導(dǎo)致組織及血中Eos增多的重要原因，F(xiàn)as抗原也參與了哮喘豚鼠Eos凋亡的調(diào)節(jié)，DM、TP、AM可促進(jìn)哮喘肺組織中的Eos表達(dá)Fas抗原，進(jìn)而加強(qiáng)細(xì)胞凋亡。發(fā)現(xiàn)選擇性的促進(jìn)Fas表達(dá)過(guò)程的制劑對(duì)清除炎癥及過(guò)敏反應(yīng)具有誘人的前景。參考文獻(xiàn)3Hebestreit H, Yousefi S, Batti I, et al. Expression and function of the Fas receptor on human blood and tissue eosinophils. Eur J Immunol,1996,26(8):17754Tsuyuki S, Bertrand C, Erard F, et al.