人肝癌細胞總RNA電轉染樹突狀細胞對T細胞的激活效應

1、人肝癌細胞總RNA電轉染樹突狀細胞對T細胞的激活效應         08-12-26 13:02:00     編輯：studa20                   作者：單鐵英 蘇安英 唐軍民 【摘要】  目的：采用Trizol一步法提取人肝癌細胞總RNA電轉染人外周血樹

2、突狀細胞（Dendritic Cell,DC），觀察其對混合T淋巴細胞的體外激活效應。方法：通過密度梯度離心法分離人外周血單核細胞，用細胞因子體外培養(yǎng)誘導其成為DC。Trizol一步法提取人肝癌細胞總RNA。通過電轉染法將人肝癌細胞總RNA導入DC內；通過混合淋巴細胞實驗，獲取DC激活的特異性效應T細胞。用MTT法測定效應T細胞的增殖率。結果：電轉染方法可將人肝癌細胞總RNA導入DC；電轉染前后DC分子表達無顯著差異。轉染了人肝癌細胞總RNA的DC可特異的激活T細胞且增殖率明顯增強（P<0.05）。結論：電轉染為人肝癌細胞總RNA導入DC提供技術上的可行性；轉染了人肝癌細胞總RNA的DC

3、可特異激活T細胞。 【關鍵詞】  樹突細胞 核糖核酸 轉染 肝腫瘤    【ABSTRACT】  Objective:To investigate the activation effect in human peripheral blood Dendritic Cell（DC)electransfecting total RNA of hepatocarcinoma cells extracted by Trizol in vitro.Methods:Monocytes obtained from human peripheral blood

4、 by density guadient centrifugation were induced into DC in the presence of cytokines in vitro.The total RNA of hepatocarcinoma cells was extracted by Trizol and was eletransfected into monocytederived DC.Effective T cells were got by mixed lymphology reaction,in which DC activated T cells gradually

5、,then the proliferation rate of effective T cells could be examined by the MTT method.Results:Electransfection could successfully make RNA into DC.There was no significant difference in DC molecule expression after the electransfection.DC with total RNA of hepatocarcinoma cells could activate specif

6、ically T cells and Proliferation rate was significant high.Conclusion:Electransfection provides a technical possibility to make hepatocarcinoma total RNA into DC.DC with total RNA of hepatocarcinoma cells can activate specifically T cells.    【KEY WORDS】  Dendritic Cells,RNA,Tran

7、sfection,Liver Neoplasms    肝癌的治療手段有多種，但對于進展期肝癌，仍然無法徹底解決腫瘤復發(fā)與轉移的問題。近年來文獻報道腫瘤細胞RNA轉染樹突狀細胞（Dendritic Cell，DC）可以誘導強烈的抗腫瘤免疫，但在用RNA電轉染DC的方法尚無報道，我們研究了肝癌細胞株Bel7402總RNA電轉染的DC對T細胞的體外激活效應，以探索其治療肝癌的可行性。    1  材料與方法    11一般資料  新鮮人外周血，購自北京市血庫。人肝癌細胞株Bel7402，由

8、北京大學基礎醫(yī)學院免疫學系惠贈。淋巴細胞分離液（Ficoll，1.077g/mL），購自上海試劑二廠。鼠抗人CD14、鼠抗人MHC、鼠抗人CD86、鼠抗人CD83、鼠抗人S100，即用型二步法生物素檢測試劑盒（PV9000）、FITC標記的第II抗體工作液購自北京中山生物技術有限公司。TRIZOL試劑盒、綠色熒光蛋白（GFP）mRNA，購自Invitrogen公司。    12  方法1640液、10%胎牛血清（FCS）和細胞因子rhGMCSF 1000U/mL；rhIL4 500U/mL繼續(xù)培養(yǎng)。第7d收獲的細胞為imDC。7402總RNA的獲得

9、60; 常規(guī)方法對肝癌細胞株Bel7402進行培養(yǎng)。以Trizol一步法抽提肝癌細胞總RNA，-20保存。測定260nm和280nm分光光度值，估計其純度并定量，進行RNA電泳觀察其18S和28S條帶完整性。    增殖指數為：實驗組OD值反應細胞對照組OD值刺激細胞對照組OD值/反應細胞對照組OD值。    2  結果    21  培養(yǎng)imDC的形態(tài)學觀察及表型分析  細胞體積增大，形態(tài)為長梭形或不規(guī)則形，并向四周伸出不規(guī)則狀的突起。表型分析:MHC+、S100+、CD8

10、6weak+、CD83weak+。    22  肝癌細胞總RNA質量檢測  本試驗中經Trizol提取的肝癌細胞總RNA，107個細胞可得到48g RNA，經RNA電泳，可見到完整的18S和28S條帶，分光光度計檢測OD260/OD280=1.821.8。證明所用RNA未降解，質量可靠。    23  電轉染人肝癌細胞總RNA后的imDC的形態(tài)學觀察及表型分析  電轉染24h后，細胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，開始貼壁生長，有少量的死亡細胞呈脫壁生長，形態(tài)變差，但絕大多數細胞可恢復至電轉染前的正常狀態(tài)。24h臺盼藍測電轉后細胞死亡率為15%25%。熒光顯微鏡下可見：在450490nm的波長觀察GFPmRNA電轉染后的imDC，電轉染45h后imDC內表達黃綠色熒光，此熒光可持續(xù)表達2430h。細胞計數：細胞中表達GFP的細胞占細胞總數的49.07%。    表型分析：接受電轉染人肝癌細胞總RNA后imDC的表型無明顯變化（P>0.05）