丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

1、丹參酮A對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制                 作者：李浩，劉開(kāi)祥，俸軍林，曾愛(ài)源，唐永剛【摘要】  目的探討丹參酮A（Tan A）對(duì)缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用及對(duì)額頂部皮質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、自由基含量、能量代謝的影響。方法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、Tan A低劑量治療組和Tan A高劑量治療組，線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型。Tan A高、低劑量治療組于術(shù)前連續(xù)灌胃給藥3 d，1次/d。用生

2、化法觀察缺血90 min再灌注24 h大鼠額頂部皮質(zhì)髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）含量、三磷酸腺苷（ATP）含量及腦含水量變化，并進(jìn)行2，3，5三苯基氯化四氮唑（TTC）染色檢測(cè)腦梗塞體積。結(jié)果Tan A治療組腦梗塞體積較缺血再灌注組減小，高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）；與缺血再灌注組比較，Tan A治療組顯著降低MPO活性、MDA含量，增加SOD 、ATP含量，降低腦組織含水量，高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。結(jié)論Tan A對(duì)缺血再灌注腦損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)，減輕氧化性損傷和改善能量代

3、謝有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  缺血再灌注； 髓過(guò)氧化物酶； 自由基； 三磷酸腺苷； 丹參酮Abstract：ObjectiveTo study the effect of Tanshinone A (Tan A)  on neutrophils infiltration and the contents of free radical and ATP in ischemic frontal and parietal cortex of cerebral ischemia reperfusion（I/R） rats.MethodsIn this experiment, rats w

4、ere randomly divided into 4 groups, namely sham operated group, I/R group,low dose Tan A treated group and high  dose Tan A treated group. The focal middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was made by suture-occluded method.Rats were pretreated with Tan A ig for 3d,respectively. After 90mi

5、n MCAO following 24h of reperfusion, the MPO activity, the contents of SOD and MDA in ischemic frontal and parietal cortex were investigated. TTC staining was used to calculate the cerebral infarct volume.ResultsCompared with I/R group,cerebral infarction volume in low dose Tan A treated group and h

6、igh  dose Tan A treated group decreased in a dose-dependent manner (all P0.05). Compared with I/R group, low and high dose Tan A treated groups dose-dependently reduced MPO activity,the content of MDA and brain water content, increased the activity of SOD and the content of ATP. ConclusionTan A

7、 may  aueviate cerebral ischemia-reperfusion injury by decreasing the inflammation reaction , free radicals and the disbanlance of energy metabolism.Key words：Ischemia-reperfusion; Myeloperoxidase; Free radical; ATP；Tanshinone A   丹參Salvia miltorrhiza Bge為唇形科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)具有活血化淤作用的中藥，已

8、被廣泛用于心腦血管疾病的治療，但其作用機(jī)制尚不十分清楚。丹參酮( Tanshinone)是丹參的有效活性組分，其中丹參酮A（Tanshinone A，Tan A） 為丹參酮中含量最高的活性成分。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，研究丹參酮A對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷缺血區(qū)額頂部皮質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、自由基含量、能量代謝、腦組織含水量及梗塞體積變化的影響，探討其對(duì)腦再灌注損傷保護(hù)作用機(jī)制。1  材料與方法1  藥品與試劑 Tan A由提供上海第一生化藥業(yè)有限公司提供，純度85。髓過(guò)氧化物酶（MPO），丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工

9、程研究所。TTC購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司。2  動(dòng)物分組及給藥方法健康Wistar大鼠，雄性，清潔級(jí)，共100只，質(zhì)量（250±30）g（廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。按隨機(jī)分組原則分成假手術(shù)組（25只）、缺血再灌注組（25只）、Tan A低劑量治療組（25只）及Tan A高劑量治療組（25只）。Tan低劑量治療組（15 mg/kg）和高劑量治療組（30 mg/kg）均于術(shù)前連續(xù)灌胃給藥3 d，1次/d，假手術(shù)組和缺血再灌注組給予等量的生理鹽水灌胃。第3天給藥后1 h建立缺血90 min再灌注24h動(dòng)物模型。3  動(dòng)物模型的建立參照Longa等1的方法制

10、備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。采用頸外動(dòng)脈插入線栓法，各組均進(jìn)行左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞。線栓采用石蠟線栓。線栓直徑約0.27 mm，插入深度約18 mm，此時(shí)線栓頭位于大腦中動(dòng)脈起始部。缺血90 min時(shí)，抽提線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分：按照 Longa等1評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各組分別在再灌注24 h進(jìn)行評(píng)分。0分：正常，無(wú)神經(jīng)學(xué)征象；1分：動(dòng)物不能完全神展右前肢；2分：動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈，出現(xiàn)追尾現(xiàn)象；3分：動(dòng)物行走向右側(cè)跌倒，或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾；4分：無(wú)自發(fā)活動(dòng)，有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分在13分為模型成功。4 MPO活性的測(cè)定 再灌注24h，將大鼠開(kāi)顱取腦，置于

11、4冰箱5 min，在冰浴下取左側(cè)距離嗅球尖端711 mm之間的額頂部皮質(zhì)，以試劑盒提供的勻漿介質(zhì)制成腦組織勻漿。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟要求操作，計(jì)算出MPO活力單位。5 MDA和SOD的測(cè)定再灌注24h，將大鼠開(kāi)顱取腦，置于4冰箱5 min，在冰浴下取左側(cè)距離嗅球尖端711 mm之間的額頂部皮質(zhì)，以試劑盒提供的勻漿介質(zhì)制成腦組織勻漿（步驟和方法同上）。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟要求操作，計(jì)算出MDA和SOD含量。6  三磷酸腺苷（ATP）含量測(cè)定再灌注24 h，將大鼠開(kāi)顱取腦，置于4冰箱5 min，在冰浴下取左側(cè)距離嗅球尖端711 mm之間的額頂部皮質(zhì)，迅速加入乙腈，混勻，冰浴離心脫蛋白

12、，離心后取上清液水系濾膜過(guò)濾后，-86保存。用高效液相測(cè)定ATP含量。7  腦含水量檢測(cè)再灌注24 h，各組隨機(jī)取5只大鼠，斷頭取腦后，快速稱(chēng)取左右大腦半球濕重，置110115烤箱內(nèi)烤至恒重，再分別稱(chēng)其干重，用(濕重- 干重) /濕重的百分比，作為衡量腦含水量指標(biāo)。8 TTC染色再灌注24h，將各組另外5只大鼠深麻后開(kāi)顱取腦。將鼠腦置于4冰箱20min后，將其切成5等份冠狀位切片，置于2TTC溶液中，水浴、多聚甲醛液固定。用計(jì)算機(jī)病理圖像分析儀及梯形法計(jì)算出梗塞灶體積，各腦片梗死灶體積之和即為梗塞體積。左側(cè)大腦半球梗死灶區(qū)呈白色，主要為額頂部皮質(zhì)和尾殼核，正常組織呈紅色。部分組織表現(xiàn)

13、為由白色向紅色過(guò)度區(qū)。9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行運(yùn)算，結(jié)果以±s表示，組間差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析。         2  結(jié)果2.1 TAN A對(duì)MPO活性的影響結(jié)果見(jiàn)表1。假手術(shù)組MPO活性呈低水平。缺血再灌注組缺血側(cè)MPO活性較假手術(shù)組明顯升高（P0.05）；TAN A高、低劑量治療組MPO活性較缺血再灌注組明顯降低（均P0.05）；高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。表1  TAN A對(duì)MPO，MDA， SOD，ATP含量，

14、腦含水量及腦梗塞體積影響（略）2.2 Tan A對(duì)MDA、SOD含量的影響缺血再灌注組缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)SOD含量下降，MDA含量升高，與假手術(shù)組比較，差異具有顯著性（P0.05）。Tan A治療組可提高額頂部皮質(zhì)SOD含量，降低MDA含量，與缺血再灌注組相比較，差異具有顯著性（P0.05）；高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。見(jiàn)表1。2.3  Tan A對(duì)ATP含量的影響 缺血再灌注組缺血側(cè)額頂部皮質(zhì)ATP含量下降，與假手術(shù)組比較，差異具有顯著性（P0.05）；Tan A治療組ATP含量升高，與缺血再灌注組相比較，差異具有顯著性（P0.05），高、低劑量組之間差

15、異亦具有顯著性（P0.05）。見(jiàn)表1。2. 4 Tan A對(duì)腦水腫的影響 缺血再灌注組缺血側(cè)腦組織含水量較假手術(shù)組明顯升高，差異具有顯著性（P0.05）； Tan A治療組降低腦組織含水量，與缺血再灌注組相比差異有顯著性(P0.05) ，高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。見(jiàn)表1。2.5 Tan A對(duì)腦梗塞體積的影響 TTC染色后，缺血再灌注24h左側(cè)大腦半球梗塞灶區(qū)呈白色，主要為額頂部皮質(zhì)和尾殼核，正常組織呈紅色。部分組織表現(xiàn)為由白色向紅色過(guò)度區(qū)。TTC染色形態(tài)學(xué)觀察顯示，用石蠟線栓法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，可使大腦中動(dòng)脈供血區(qū)出現(xiàn)恒定的、復(fù)制性良好的

16、梗塞灶（圖1）。 Tan A高、低劑量組梗死體積較缺血再灌注組顯著減?。≒0.05）；高、低劑量組之間差異亦具有顯著性（P0.05）。3 討論   何麗娜等2研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮對(duì)原代大鼠神經(jīng)細(xì)胞缺血性損傷有保護(hù)作用。本研究結(jié)果也證實(shí)，腦缺血再灌注損傷給予Tan A治療，可明顯減少減輕再灌注損傷腦水腫及梗塞體積，對(duì)缺血腦組織有保護(hù)作用，高劑量GBE的保護(hù)效果更顯著。   MPO主要存在于中性粒細(xì)胞的噬天青顆粒中。MPO活性反映中性粒細(xì)胞在腦組織中浸潤(rùn)程度。我們前期研究已證實(shí)，腦缺血再灌注損傷出現(xiàn)了中性粒細(xì)胞參與為標(biāo)志的炎癥反應(yīng)過(guò)程，減輕腦缺血再灌注損傷后炎癥

17、反應(yīng)對(duì)缺血腦組織有保護(hù)作用3。本研究結(jié)果提示，腦缺血再灌注損傷給予Tan A腹腔注射治療，可明顯減少缺血再灌注后MPO活性，減少中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，對(duì)缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)有抑制作用。胡霞敏等4預(yù)防性用藥給予缺血再灌注損傷大鼠Tan A治療，發(fā)現(xiàn)Tan A對(duì)缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)也有抑制作用，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。   缺血性腦卒中損傷機(jī)制中自由基連鎖反應(yīng)是重要一環(huán)。當(dāng)腦缺血特別是再灌注期，自由基生成和代謝的動(dòng)態(tài)平衡被打破，氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生，活性氧簇生成增多，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物如MDA等，最終導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂；同時(shí)，自由基誘導(dǎo)DN

18、A、RNA、蛋白質(zhì)交聯(lián)，生物活性大分子斷裂、解聚；線粒體變性，細(xì)胞凋亡或壞死。同時(shí)，當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)， 腦組織供血不足，能量合成物質(zhì)供應(yīng)缺乏，細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降， Na,K+-ATP酶活性降低，大量Na+內(nèi)流，K+外流，細(xì)胞去極化，細(xì)胞內(nèi)游離Ca2濃度升高，導(dǎo)致了自由基的生成遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了機(jī)體的清除能力，造成自由基堆積，形成惡性循環(huán)，加重腦損傷。SOD則能夠清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活性間接反映了機(jī)體清除自由基的能力。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tan A可顯著降低缺血側(cè)腦組織中MDA的含量，提高腦組織SOD活性和ATP水平，提示Tan A能降低氧化應(yīng)激程度，減少體內(nèi)自由基的形成，增加機(jī)體清除自由基的能力，并能改善能量代謝障礙，可能與Tan A抑制急性腦缺血細(xì)胞鈣超載有關(guān)5。   綜上所述，Tan A對(duì)缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減少缺血再灌注后炎癥反應(yīng)，減輕氧化性損傷和改善能量代謝障礙有關(guān)，高劑量Tan A的保護(hù)效果更顯著?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occusion without cra