抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定

1、抗呼吸道合胞病毒免疫噬菌體抗體庫的構(gòu)建及初步鑒定                作者：汪治華, 張國成*, 許東亮, 孫 新, 李小青, 李思袖, 張學紅, 聶曉晶, 豆玉鳳【摘要】  目的: 構(gòu)建小兒呼吸道合胞病毒感染患者人源性噬菌體抗體庫, 搭建人源性抗體制備的技術(shù)平臺, 為小兒呼吸道合胞病毒感染發(fā)病機制的研究、 診斷、 和預(yù)防提供新的有效途徑。方法: 從52例呼吸道合胞病毒感染患兒外周血淋巴細胞中提取總RNA, 并逆轉(zhuǎn)錄

2、為cDNA。用PCR擴增輕鏈和重鏈Fd段（即重鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)）基因, 并將擴增的輕鏈和重鏈基因片段克隆于pComb3x噬粒載體, 電轉(zhuǎn)化XL1Blue大腸桿菌, 經(jīng)輔助噬菌體M13K07超感染后構(gòu)建成Fab段噬菌體抗體庫。對此抗體庫雙酶切進行鑒定, 并用呼吸道合胞病毒顆粒作抗原進行初步篩選。結(jié)果: 經(jīng)過重輕鏈基因的重組, 成功構(gòu)建一免疫噬菌體抗體基因庫, 共有2.6×106個不同的克隆菌, 其中70%的克隆均含有輕鏈和重鏈Fd 基因。因此, 所構(gòu)建的噬菌體抗體庫的庫容量為1.8×106, 經(jīng)初步篩選, 抗體庫得到了不同程度的富集。結(jié)論: 利用基因重組技術(shù)和噬菌體展示

3、技術(shù), 成功構(gòu)建小兒呼吸道合胞病毒感染患者人源性免疫噬菌體抗體庫, 為進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  抗體庫; 噬菌體展示技術(shù); Fab抗體; 呼吸道合胞病毒; 兒童    隨著分子生物學的, 基因工程抗體技術(shù)的出現(xiàn), 尤其是噬菌體抗體庫技術(shù), 為各種不同免疫原人源性抗體的制備提供了新途徑, 成為抗體工程領(lǐng)域革命性的進展1。我們以52例呼吸道合胞病毒感染患兒外周血淋巴細胞作為基因來源, 成功地構(gòu)建了一個人源性Fab段免疫噬菌體抗體庫, 并對其進行了初步鑒定, 為研制診斷、 治療和預(yù)防小兒呼吸道病毒感染的基因工程藥物奠定了基礎(chǔ), 同時也將解決鼠源性

4、抗體在臨床應(yīng)用中存在的不足。    1  材料和方法    1.1  材料  選取52例經(jīng)ELISA法檢測呼吸道合胞病毒IgM和/或IgG抗體陽性的患兒, 每例患兒抽取血液2 mL, 共約100 mL。噬粒載體 pComb3x（含氨芐青霉素抗性基因）, 大腸桿菌菌珠 XL1Blue（帶四環(huán)素抗性基因）, 輔助噬菌體M13K07(具卡那霉素抗性基因)由第四軍醫(yī)大學李郁博士惠贈。焦碳酸二乙酯購自AMRESCO公司, TRIzol購自Invitrogen公司, RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司, T

5、aq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司, 限制性內(nèi)切酶Spe I、 Xho I、 Sac I、 Xba I購自Promega公司, 呼吸道合胞病毒Long株（RSVLong）, 由本實驗室保存。    1.2  方法    2  結(jié)果    2.1  淋巴細胞的分離和總RNA的提取  提取的總RNA凝膠電泳顯示條帶完整, A260/A280值為2.03, 說明提取的總RNA質(zhì)量較好(圖1)。1     &#

6、160;       圖1  總RNA凝膠電泳分析    2.2  輕鏈基因和重鏈Fd段基因的擴增  取適量輕鏈基因和重鏈Fd段基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳, 在約700 bp處均可見擴增條帶, 與預(yù)期的大小相符（圖2）。    2.3  輕鏈基因庫和Fab段基因庫的構(gòu)建及鑒定  從輕鏈基因庫14 mL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中取1 L稀釋后鋪于瓊脂平板上, 共長出205個單克隆菌落, 從而推算轉(zhuǎn)化子數(shù)為205×14×1

7、03=2.9×106; 隨機挑取的10個菌落的質(zhì)粒經(jīng)Sac I和Xba I雙酶切后電泳, 其中有8個可得到700 bp左右DNA片段, 為輕鏈基因插入片段, 重組率為80, 則其庫容量為2.9×106×0.8=2.3×106。用同樣的方法, 得到Fab抗體基因庫轉(zhuǎn)化子數(shù)為2.6×106, 隨機挑取的13個克隆中有9個酶切出Fd段DNA片段, 則重組率為9/13(約70)（圖3）, 則其庫容量為2.6×106×0.7=1.8×106。    2.4  Fab段噬菌體抗體庫的構(gòu)建

8、及初步篩選  以RSV作為抗原對噬菌體抗體庫進行了3輪“吸附洗脫擴增”的篩選, 測定抗體庫滴度分別為1.2×105、 1.8×106、 9.4×106 pfu, 顯示了明顯增加的趨勢, 第3輪比第1輪增加了78倍, 說明特異性噬菌體得到了富集; 每輪均經(jīng)ELISA檢測, A值分別為0.23、 0.56、 1.05, 隨著篩選輪數(shù)的增加而逐漸增加。    3  討論    呼吸道合胞病毒感染在兒科很常見, 每年均有暴發(fā), 發(fā)病率高, 90%在2歲前均感染過RSV3, 但目前尚無理想的抗病

9、毒藥物。1891年, Emil von Behring首次將來自動物的白喉抗毒素血清用于白喉感染患兒的取得較為滿意的療效, 從而為抗體用于感染性疾病的治療奠定了基礎(chǔ)4。雜交瘤技術(shù)的創(chuàng)立, 為mAb用于感染性疾病的治療提供了可能, 但是鼠源性的mAb因HAMA反應(yīng)等副作用而受限于臨床應(yīng)用5。噬菌體抗體庫技術(shù)的出現(xiàn), 首次為獲得完全人源性的mAb提供了一條佳徑。噬菌體展示技術(shù)是一種分子多樣性技術(shù), 它讓大量不同的多肽或蛋白展示在絲狀噬菌體的表面6。針對幾乎任何抗原的高親和力特異性抗體均可在噬菌體抗體庫中篩選出, 使mAb用于腫瘤、 感染性疾病等的診斷、 治療成為可能7,  8。與費時而繁

10、雜的mAb技術(shù)相比, 噬菌體抗體有穩(wěn)定的基因來源, 可以通過DNA重組, 迅速而地制備各種人源性抗體而無動物免疫原性, 從而適合體內(nèi)診斷與治療9。    有兩種途徑可以獲得高親和力的抗體, 一種是構(gòu)建大容量的天然抗體庫, 另外就是構(gòu)建免疫抗體庫10。從免疫抗體庫中獲得的抗體其親和力較從天然抗體庫中獲得的要高, 而且無交叉免疫源性。我們選用呼吸道合胞病毒感染患兒的淋巴細胞作為基因來源, 將減少抗體的多樣性, 但可以從相對較小庫容的抗體庫中獲得高親和力特異性抗體。通過初步鑒定, 我們所構(gòu)建的抗體基因庫庫容量為1.8×106, 經(jīng)過3輪淘篩, 特異性Fab抗體

11、得到較好的富集。因此, 我們成功構(gòu)建了一免疫噬菌體抗體庫, 為后續(xù)的實驗和進一步研究打下了良好的基礎(chǔ), 也將有益于小兒呼吸道合胞病毒感染的診斷、 治療和預(yù)防。【】  1 Hoogenboom HR, de Bruine AP, Hufton SE, et al. Antibody phage display technology and its applicationsJ. Immuno Technol, 1998, 4(1): 1-20. 2 李曉琳, 侯宗柳, 劉建生, 等. 超大容量非免疫人源性Fab抗體庫的構(gòu)建J. 云南醫(yī)藥, 2006, 27(2): 94-97.3 Ogr

12、a PL. Respiratory syncytial virus: the virus, the disease and the immune responseJ. Paeditr Respir Rev, 2004, 5(2): 119-126.4 何 維. 醫(yī)學免疫學M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2006: 24-48.5 Hughes D. Therapeutic antibodies make a comebackJ. Drug Discovery Today, 1998, 3(10): 4396 Clackson T, Lowman HB. Phage displayA pract

13、ical approachM. Oxford University Press Uk, 2004: 15-28.7 Binyamina L, Borghaei H, Weiner LM. Cancer therapy with engineered monoclonal antibodiesJ. Update Cancer Therapeutics, 2006, 1(2): 147-157.8 Kang XP, Yang BA, Hu YY, et al. Human neutralizing Fab molecules against severe acute respiratory syndrome coronavirus generated by phage displayJ. Clin & Vac Immunol, 2006, 13(8): 953-957. 9 Azzazy HM, Highsmith WE. Phage display technology: clinical applications and recent innovationsJ. Clin Biochem, 2002, 35(6): 425-445.10 Bowley DR, Labri