干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化方法及各類誘導(dǎo)試劑的配置

1、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法及各類誘導(dǎo)試劑的配置YAO Xiang由于易分離獲得、 免疫原性低且具有多向誘導(dǎo)分化潛能，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 （Bonemarrow stroma stem cells，MSCs）成為了組織工程與再生醫(yī)學(xué)中理想的種子細(xì)胞。正是由于上述原因，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成為了很多研究者關(guān)注并使用的模型細(xì)胞。本文將著重于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化、成軟骨誘導(dǎo)分化和成脂誘導(dǎo)分化三個方向加以介紹 ，相關(guān)內(nèi)容有利于實驗研究者快速而有效地配制上述各類誘導(dǎo)分化試劑，進(jìn)而極大縮短前期探索實驗和文獻(xiàn)搜索整合所耗費的大量時間。 本文主要內(nèi)容涵蓋：1. 成骨誘導(dǎo)分化中誘導(dǎo)液的添加方案 （包含換液周期及誘導(dǎo)試劑濃

2、度）2. 成骨誘導(dǎo)分化中各類誘導(dǎo)試劑的產(chǎn)品信息及母液配置方案3. 成脂誘導(dǎo)分化中誘導(dǎo)液的添加方案 （包含換液周期及誘導(dǎo)試劑濃度）4. 成脂誘導(dǎo)分化中各類誘導(dǎo)試劑的產(chǎn)品信息及母液配置方案5. 成骨與成脂共誘導(dǎo)液的添加方案（包含換液周期及誘導(dǎo)試劑濃度）6. 成骨與成脂共誘導(dǎo)試劑的產(chǎn)品信息及母液配置方案7. 成軟骨誘導(dǎo)分化中誘導(dǎo)液的添加方案（包含換液周期及誘導(dǎo)試劑濃度）8. 成軟骨誘導(dǎo)分化中各類誘導(dǎo)試劑的產(chǎn)品信息及母液配置方案注：下述誘導(dǎo)方案經(jīng)多次實驗驗證是行之有效的，筆者利用相關(guān)方案參與發(fā)表的部分參考文獻(xiàn)如下：1. Yao X, Peng R, DingJD*. Cell-materialinte

3、ractions revealed via material techniques of surface patterning.Advanced Materials , 2013;25:5257-86. ( 材料領(lǐng)域 TOP 期刊 )2. Yao X, Hu YW, Cao B, Peng R, Ding JD*. Effects of surface molecular chirality on adhesion and differentiationof stem cells. Biomaterials, 2013;34:9001-9. ( 生物材料領(lǐng)域TOP 期刊 )3. Yao X,

4、Peng R, Ding JD*. Effects of aspect ratios of stem cells on lineage commitments with and without induction media. Biomaterials , 2013;34:930-9.4. Peng R, Yao X, Cao B, Tang J, Ding JD*. The effect of culture conditions on the adipogenic and osteogenic inductions of mesenchymal stem cells on micropat

5、terned surfaces. Biomaterials , 2012;33:6008-19. (IF:8.39)5. Peng R, Yao X, Ding JD*. Effect of cell anisotropy on differentiation of stem cells on micropatterned surfaces through the controlled single cell adhesion. Biomaterials, 2011;32:8048-57.首先需要說明的是骨髓基質(zhì)干細(xì)胞正常傳代培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為“基礎(chǔ)培養(yǎng)液”，一般2-3 天更換一次新的培養(yǎng)液。

6、基礎(chǔ)培養(yǎng)液是基于低糖的DMEM（ Dulbecco's modified Eagle medium，后文均以簡寫的 DMEM 替代）所配置，其中含有 100 U/ml 的青霉素， 100 g/ml的鏈霉素， 2mM 的 L- 谷氨酰胺和 10%的胎牛血清（ Bovine serum albumin， FBS）。上述試劑全為 Gibco 品牌（下述誘導(dǎo)液中也需用到這些試劑，直接購買使用即可） 。一成骨誘導(dǎo)分化中誘導(dǎo)液的添加方案（包含換液周期及誘導(dǎo)試劑濃度）對于單獨的成骨誘導(dǎo)，干細(xì)胞需在“成骨誘導(dǎo)液中”中連續(xù)培養(yǎng)，采用每 3 天更換一次新誘導(dǎo)液的方案進(jìn)行。 就總的時間跨度來說， 一般短的

7、1 周，長的 3-4 周都有，具體時間跨度需要依據(jù)你的實驗?zāi)康亩?。成骨誘導(dǎo)液是基于 高糖的 DMEM （含 100 U/ml 的青霉素， 100 g/ml的鏈霉素，2 mM 的 L-谷氨酰胺）所配置，其中含有 10%的 FBS（胎牛血清）、50 M的抗壞血酸、 10 mM 的 甘-油磷酸鈉和 100 nM 的地塞米松。具體母液配置方案及試劑信息詳見下部分內(nèi)容。其中單位 M表示的是 mol/L（下同）。二成骨誘導(dǎo)分化中各類誘導(dǎo)試劑的產(chǎn)品信息及母液配置方案試劑名稱試劑信息母液配置方案母液最終加入比例（母液：培養(yǎng)液）地塞米松產(chǎn)品編號 D4902母液濃度 100M；1： 1000dexamethas

8、oneCAS 號 50-02-2約 0.19235 毫克加入到品牌 SIGMA20 微升乙醇中溶解， 再用 PBS 稀釋到 50毫升；過濾除菌后用小管封裝并冷凍保存；甘-油磷酸鈉產(chǎn)品編號 G9422母液濃度1M ；1： 100 -GlycerophosphateCAS 號 154804-51-0約 4.3208克加入到 20disodium salt hydrateSIGMA毫升的 PBS 中溶解；過濾除菌后用小管封裝并冷凍保存；抗壞血酸產(chǎn)品編號 49752母液濃度 5mM ；1： 1002-Phospho-L-ascorbicCAS 號 66170-10-3約 64.41 毫克加入到 40a

9、cid trisodium saltSIGMA毫升的 PBS 中溶解；過濾除菌后用小管封裝并冷凍保存；三成脂誘導(dǎo)分化中誘導(dǎo)液的添加方案（包含換液周期及誘導(dǎo)試劑濃度）對于單獨的成脂誘導(dǎo)，干細(xì)胞需首先在“成脂誘導(dǎo)液”中培養(yǎng) 2 天，隨后在“成脂孵育液”中培養(yǎng) 1 天，之后再依次進(jìn)行上述循環(huán)。就總的時間跨度來說，一般短的 1 周，長的 3-4 周都有，具體時間跨度需要依據(jù)你的實驗?zāi)康亩?。成脂誘導(dǎo)液和孵育液均是基于高糖的 DMEM （含 100 U/ml 的青霉素， 100 g/ml的鏈霉素， 2 mM 的 L- 谷氨酰胺）所配置，其中成脂誘導(dǎo)液中含有10%的FBS、1 M的地塞米松、 200 M的

10、吲哚美辛、 10 g/ml的胰島素和 0.5 mM 的3-Isobutyl-1-methylxanthine；成脂孵育液中則含有 10%的 FBS 和 10 g/ml的胰島素。具體母液配置方案及試劑信息詳見下部分內(nèi)容。四成脂誘導(dǎo)分化中各類誘導(dǎo)試劑的產(chǎn)品信息及母液配置方案試劑名稱試劑信息母液配置方案母液最終加入比例（母液：培養(yǎng)液）地塞米松dexamethasone胰島素Insulin human吲哚美辛indomethacin3- 異丁基 -1- 甲基黃嘌呤3-Isobutyl-1-methylxanthine細(xì)胞培養(yǎng)級別DMSO產(chǎn)品編號D4902CAS 號 50-02-2品牌 SIGMA產(chǎn)品編

11、號I3536CAS 號 11061-68-0SIGMA產(chǎn)品編號I7378CAS 號 53-86-1SIGMA產(chǎn)品編號I7018CAS 號 28822-58-4SIGMA產(chǎn)品編號D2650母液濃度 100M1： 100約 0.19235 毫克加入到20 微升乙醇中溶解， 再用 PBS 稀釋到 50 毫升分子量5807.57依 據(jù) 分 子 量 和最終濃度10 g/ml自行計算母液濃度200mM1： 1000約 71.56 毫克加入到 1毫升的 DMSO 中溶解母液濃度 0.5M1： 1000約 100 毫克加入到 0.9毫升的 DMSO 中溶解作為配置母液的溶劑-Dimethyl sulfoxid

12、eCAS 號 67-68-5SIGMA使用五成骨與成脂共誘導(dǎo)液的添加方案（包含換液周期及誘導(dǎo)試劑濃度）對于成骨和成脂的共誘導(dǎo)， 干細(xì)胞首先在“成骨成脂共誘導(dǎo)液” 中培養(yǎng) 3 天，隨后在“成骨誘導(dǎo) -成脂孵育液”中繼續(xù)培養(yǎng) 3 天。之后再依次進(jìn)行上述循環(huán)。具體的總時間跨度需要依據(jù)你的實驗?zāi)康亩ā３晒浅芍舱T導(dǎo)液和成骨誘導(dǎo) -成脂孵育液均是基于高糖的 DMEM 所配置（含 100 U/ml 的青霉素， 100 g/ml的鏈霉素， 2 mM 的 L- 谷氨酰胺）。其中成骨成脂共誘導(dǎo)液中含有 10%的 FBS、1 M的地塞米松、 200 M的吲哚美辛、 10 g/ml的胰島素、 0.5 mM 的 3

13、-Isobutyl-1-methylxanthine、50 M的抗壞血酸和 10 mM 的 甘-油磷酸鈉；成骨誘導(dǎo) -成脂孵育液中含有 10%的 FBS、100 nM 的地塞米松、 10 g/ml的胰島素、 50 M的抗壞血酸和 10 mM 的 甘-油磷酸鈉。具體母液配置方案及試劑信息詳見下部分內(nèi)容。六成骨與成脂共誘導(dǎo)試劑的產(chǎn)品信息及母液配置方案試劑名稱試劑信息母液配置方案母 液 最 終 加入比例（母液：培養(yǎng)液）地塞米松產(chǎn)品編號D4902dexamethasoneCAS 號 50-02-2品牌 SIGMA甘-油磷酸鈉產(chǎn)品編號 G9422 -GlycerophosphateCAS 號 15480

14、4-51-0disodium salt hydrateSIGMA抗壞血酸產(chǎn)品編號 497522-Phospho-L-ascorbicCAS 號 66170-10-3acid trisodium saltSIGMA胰島素產(chǎn)品編號 I3536Insulin humanCAS 號 11061-68-0SIGMA吲哚美辛產(chǎn)品編號 I7378indomethacinCAS 號 53-86-1SIGMA3- 異丁基 -1- 甲基黃嘌產(chǎn)品編號 I7018呤CAS 號 28822-58-43-Isobutyl-1-SIGMAmethylxanthine母液濃度 100M1： 1000約0.19235 毫克加入

15、到或 1：100（看具20微升乙醇中溶解， 再體終濃度）用 PBS 稀釋到 50 毫升母液濃度 1M1： 100約 4.3208 克加入到 20毫升的 PBS 中溶解母液濃度 5mM1： 100約 64.41 毫克加入到 40毫升的 PBS 中溶解分子量5807.57依 據(jù) 分 子 量 和最終濃度10 g/ml自行計算母液濃度200mM1： 1000約 71.56 毫克加入到 1毫升的 DMSO 中溶解母液濃度0.5M1： 1000約 100 毫克加入到 0.9毫升的 DMSO 中溶解細(xì)胞培養(yǎng)級別DMSO產(chǎn)品編號D2650作為配置母液的溶劑-Dimethyl sulfoxideCAS 號 67

16、-68-5使用SIGMA七成軟骨誘導(dǎo)分化中誘導(dǎo)液的添加方案（包含換液周期及誘導(dǎo)試劑濃度）對于成軟骨誘導(dǎo)，干細(xì)胞需在“成軟骨誘導(dǎo)液”中連續(xù)培養(yǎng)，約2-3 天更換一次新的培養(yǎng)液。就總的時間跨度來說，一般短的1 周，長的 3-4 周都有，具體時間跨度需要依據(jù)你的實驗?zāi)康亩?。成軟骨是基于高糖?DMEM 所配置（含 100 U/ml 的青霉素， 100 g/ml的鏈霉素， 2 mM 的 L- 谷氨酰胺）。成軟骨誘導(dǎo)液中包含 5%的 FBS、 10 ng/mL 的TGF-1、 10 nM 的地塞米松、 50 g/mL的維生素 C 磷酸鹽、 1% ITS+1。具體母液配置方案及試劑信息詳見下部分內(nèi)容。八成軟骨誘導(dǎo)分化中各類誘導(dǎo)試劑的產(chǎn)品信息及母液配置方案試劑名稱試劑信息母液配置方案母液最終加入比例（母液：培養(yǎng)液）地塞米松產(chǎn)品編號 D4902母液濃度 10g/mL1： 1000dexamethasoneCAS 號 50-02-2約 0.2 毫克加入到20品牌 SIGMA微升乙醇中溶解， 再用PBS 稀釋到 20 毫升ITS+1liqu