納子法電針治療對哮喘模型豚鼠嗜酸性粒細胞凋亡的影響

1、    納子法電針治療對哮喘模型豚鼠嗜酸性粒細胞凋亡的影響作者：蔡彥， 陳文裕， 陳創(chuàng)榮， 揭西娜， 余瑾    作者單位：廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405【摘要】  【目的】觀察納子法電針治療對哮喘模型豚鼠嗜酸性粒細胞（Eos）凋亡的影響?！痉椒ā繉⒅浑嗍箅S機分為組：申時（：）電針組、巳時（：）電針組、模型組及正常對照組；除正常對照組外，其他組均采用雞卵清蛋白復制哮喘模型，治療組分別于不同時段取定喘、肺俞、經(jīng)渠穴電針治療；采用蘇木素伊紅（）染色法和脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記（U）

2、法，檢測Eos計數(shù)及肺組織中Eos凋亡率。【結(jié)果】模型組Eos計數(shù)顯著性升高（.）,Eos凋亡率無顯著性變化；申時電針組和巳時電針組Eos計數(shù)均顯著性降低（.），Eos凋亡率均顯著性升高（.），其中申時電針組項指標優(yōu)于已時電針組（.或.）。【結(jié)論】按時辰取穴的納子法電針治療哮喘的療效優(yōu)于不按時辰治療者，其機制可能與降低模型豚鼠氣道的Eos計數(shù)與凋亡率有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】  哮喘針灸療法； 納子法； 肺組織病理學； 細胞凋亡； 疾病模型，動物； 豚鼠目前哮喘的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升態(tài)勢，如何更有效地治療哮喘成為全球醫(yī)學界的一大難題。中醫(yī)學采用針灸手段治療哮喘療效確切，其中納子法是中醫(yī)時間

3、醫(yī)學代表的一種經(jīng)典針灸方法，強調(diào)不同時辰臟腑氣血盛衰狀況不同，針灸效應(yīng)亦不同。有學者2認為子午流注納子法的優(yōu)越性就在于強調(diào)選擇針灸時間的同時亦強調(diào)選取適當穴位, 從而最大限度地發(fā)揮穴位的效應(yīng)。但目前尚未見運用納子法電針治療哮喘的相關(guān)報道。本實驗觀察納子法電針治療對哮喘模型豚鼠的治療效果，以進一步明確其治療機制，現(xiàn)報道如下。1  材料與方法1.1  動物及分組  健康豚鼠48只（由中山大學實驗動物中心提供，編號0018507） ，體質(zhì)量350400g，雌雄各半，隨機分為4組： 申時電針組（A組）、巳時電針組（B組）、模型組（C組）和正常對照組（D組），每組12只。1

4、.2  主要試劑與儀器  雞卵清蛋白（Sigma 產(chǎn)品，批號：A5503）；多聚甲醛（天津百世化工，批號：915）；脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）試劑（Chemicongoncan公司產(chǎn)品，批號：S7100）；電針機（SLT-B型全信息電針治療機）；超聲霧化器（粵華WH-2000，粵汕）；定量分析生物顯微圖像光學處理系統(tǒng)（南方醫(yī)科大學病理教研室提供）。1.3  模型復制3  A、B、C3組動物均以100g/L雞卵清蛋白液1mL腹腔注射致敏。致敏后第7天將3組動物置特制激發(fā)箱內(nèi)，以10g/L雞卵清蛋白溶液噴霧激發(fā)，按個體差異每次 2

5、10min , 直至“哮喘”發(fā)作（點頭呼吸） , 連續(xù)5d。正常對照組以等容積生理鹽水代替。1.4  納子法電針治療  造模成功后組于肺經(jīng)晝夜氣血盛衰的峰值申時（15：0017：00），組于肺經(jīng)晝夜氣血盛衰的非峰非谷值巳時（9：0011：00），取定喘、肺俞、經(jīng)渠穴電針治療（取穴方法參照實驗針灸學4）。每次治療1015min，1次/d，6d為療程，共治療2個療程。1.5  病理學檢查  末次噴霧激發(fā)后第2天，各組動物麻醉后取出右肺，標本用100g/L多聚甲醛固定，從固定部位切取右肺組織塊。1.6  肺組織中嗜酸性粒細胞（Eos）計數(shù)及Eos凋亡

6、率測定  切片分別做常規(guī)蘇木素伊紅（HE）染色和TUNEL標記。原位凋亡標記方法參考試劑盒說明及文獻5。凋亡陽性細胞核呈棕黃或棕褐色，與同一來源的組織HE染色對照，鑒別為Eos。細胞計數(shù)方法為在顯微鏡下每張切片分別連續(xù)數(shù)10個高倍視野（×400）的Eos （HE染色）和凋亡Eos （TUNEL原位凋亡標記）總數(shù)，計算凋亡細胞所占相應(yīng)細胞的百分比即為Eos凋亡率。1.7  統(tǒng)計學處理  采用SPSS 11.0進行多個樣本均數(shù)間兩兩比較的q檢驗。2  結(jié)果2.1  HE染色法觀察  圖1結(jié)果顯示，肺組織切片正常對照組支氣管及肺泡

7、結(jié)構(gòu)正常，幾乎沒有Eos。模型組的細、小支氣管管壁和伴行動脈周圍有較多的Eos、漿細胞和淋巴細胞浸潤，同時可見支氣管黏膜皺壁增多、基底膜增厚、平滑肌增生、管腔縮窄或被黏液栓和炎性細胞閉塞等現(xiàn)象。兩治療組炎性改變不及模型組的變化明顯。巳時治療組的肺泡發(fā)現(xiàn)有中量的Eos、漿細胞和淋巴細胞浸潤的炎癥滲出，較少發(fā)現(xiàn)有明顯的支氣管基底膜增厚、平滑肌增生、管腔狹窄、或者被黏液栓和炎癥細胞閉塞等現(xiàn)象。而申時治療組只有少量到中量的炎癥滲出，肺泡結(jié)構(gòu)較為清晰，未發(fā)現(xiàn)有明顯的支氣管基底膜增厚、管腔狹窄或者被黏液栓和炎癥細胞閉塞等現(xiàn)象。2.2  TUNEL染色法觀察  圖2結(jié)果顯示，兩治療組中E

8、os的TUNEL陽性細胞數(shù)相對增多；模型組Eos的數(shù)量較多，其TUNEL陽性細胞卻少見；正常對照組Eos的數(shù)量較少，其TUNEL陽性細胞亦少見。表結(jié)果顯示，申時電針組與巳時電針組均可顯著降低Eos計數(shù)，升高Eos凋亡率（.），且申時電針組項指標與巳時電針組比較均有顯著性差異（.或.）。表1  各組豚鼠肺組織中Eos計數(shù)及Eos凋亡率比較（略）Table 1  Comparison of lung EOS count and EOS apoptotic rate in various groups統(tǒng)計方法：q  檢驗；.,與正常對照組比較；.，與模型組比較；.，.,

9、與巳時電針組比較圖1  各組光鏡下豚鼠肺組織形態(tài)比較（染色，×400）（略）Figure 1  Features of guinea pig lung tissue under light microscope （HE stain，×400）圖2  各組豚鼠肺組織變化比較（L染色，×400倍）（略）Figure 2  Features of guinea pig lung tissue under light microscope（TUNEL stain，×400）3  討論  

10、60; 本實驗選用雞卵清蛋白溶液腹腔注射并噴霧法復制哮喘模型，該方法操作簡易、成功率高、可重復性強，已在實驗研究中得到廣泛應(yīng)用6。    在觀察指標選擇上，Eos是目前得到公認的哮喘氣道炎癥的主要效應(yīng)細胞7，因此，如能使浸潤于肺組織中的Eos消散，對哮喘癥狀的改善極為有利。哮喘氣道中的Eos可能有5種減少的途徑：進入氣道組織的Eos數(shù)目減少；氣道組織內(nèi)原有的Eos大量轉(zhuǎn)移、分布到其他器官；Eos壞死性死亡；Eos凋亡；Eos進入氣道腔，排出體外。在上述方式中，目前認為最為可能的是Eos的凋亡8-9。陳金等10研究證明哮喘與嗜酸性粒細胞凋亡有關(guān)。與其他細胞凋亡檢測方

11、法相比，本實驗所采用的TUNEL染色法是一種較為敏感和準確的方法，并可對凋亡細胞進行定量分析。但是在肺組織中確定凋亡細胞為嗜酸性粒細胞存在著一定難度，我們首先在TUNEL片上找到細胞核呈棕黃或棕褐色細胞的凋亡細胞，然后將與之對應(yīng)的HE片進行鑒別。但是由于石蠟切片有一定的厚度，有時HE片和TUNEL片不能一 一對應(yīng)，存在著一定困難，如何提高這方面的鑒別水平有待進一步的研究。    在治療方法選擇上，針灸作為一種污染少的自然療法治療哮喘發(fā)揮了一定的優(yōu)勢，運用納子法電針治療哮喘更具優(yōu)越性。中醫(yī)學強調(diào)“人與天地相參也，與日月相應(yīng)也”，即天之陰陽隨時間遞相變化,勢必引起人體

12、陰陽隨時間發(fā)生相應(yīng)改變，故人體十二經(jīng)脈內(nèi)應(yīng)臟腑,外應(yīng)十二時辰,晝夜十二時辰經(jīng)脈氣血盛衰變化有其節(jié)律。“當氣血流注某經(jīng)所屬時辰時，該經(jīng)氣血旺，臟氣盛，穴位開，表現(xiàn)為該經(jīng)的腧穴，該經(jīng)所屬的臟腑功能增強、興奮，對治療的敏感性增高”11。而“每一經(jīng)盛時為24h出現(xiàn)1次,所以其衰時則在盛時之后12h之時,衰后12h又值當盛之時”12。    在取穴擇時上，按納子法原則“虛則補其母, 實則瀉其子, 不虛不實取本經(jīng)本穴”原則選取手太陰肺經(jīng)本穴經(jīng)渠,同時選用與肺密切相關(guān)的定喘、肺俞2穴。此2穴是針灸臨床用以治療肺系疾病的常用有效穴位，可起到調(diào)整肺功能、增強肺抵抗力以及促進病愈之功

13、效13?；诖?根據(jù)納子法理論，本實驗選擇肺經(jīng)晝夜氣血盛衰的峰值時辰申時與非峰非谷值時辰巳時 ,對哮喘模型豚鼠分別采用電針定喘、肺俞、經(jīng)渠3穴治療,以觀察擇時治療的效應(yīng)。本實驗結(jié)果顯示，哮喘模型豚鼠經(jīng)電針定喘、肺俞、經(jīng)渠穴治療后，Eos計數(shù)值降低，Eos凋亡率上升，與模型組比較有顯著性差異（.或.），說明針灸定喘、肺俞、經(jīng)渠穴有降低氣道局部的Eos計數(shù)、提高哮喘模型豚鼠氣道周圍Eos凋亡率的作用，且申時施治，即肺經(jīng)氣血旺盛時有良好療效，證實了是否擇時治療之間具有顯著性差異，揭示時辰與一定的穴位配伍可產(chǎn)生協(xié)同作用，而且子午流注納子法的時辰穴位配伍具有優(yōu)越性, 為提高臨床療效提供了實驗依據(jù)。同時也

14、證實了傳統(tǒng)納子法的基本合理內(nèi)核，即不同時辰機體氣血盛衰狀態(tài)不同，其針灸效應(yīng)也不相同，提示臨床治療時應(yīng)盡量采用該疾病所處經(jīng)脈氣血旺的時辰。    但在本實驗中，模型組的凋亡率較正常組的稍高，是否因為較多數(shù)量的Eos本身能夠使凋亡增加還需進一步研究。兩治療組的Eos計數(shù)、Eos凋亡率尚未恢復至正常水平，可能與治療時間較短有關(guān)。另一方面也說明了哮喘是一種慢性頑固性疾患，提示納子法對哮喘氣道局部炎癥的長期治療效果有待于進一步的實驗及臨床觀察來確定?！緟⒖嘉墨I】  1馬文珠.針灸治療哮喘的臨床研究近況J.針灸臨床雜志,1997,13（10）：41.2涂乾.子午流注

15、納子法對大鼠乙酸性胃潰瘍愈合質(zhì)量影響的實驗研究J.武漢市職工醫(yī)學院學報,2001,29（3）：21.3唐純志,賴新生,張毅敏，等.穴位敷貼對哮喘豚鼠轉(zhuǎn)化生長因子-1影響的實驗研究J.新中醫(yī),2005,37（4）：94.4李忠仁.實驗針灸學M.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：105.5Nonclercq D, Revese D,Toubeau G,et al.In situ demonstration of apoptotic gern cells in an experimental model of chemical castrationJ.Biochemical, 1997,1：12 .6呂國平,崔德建.介紹一種建立大鼠哮喘模型的實驗方法J.中華結(jié)核和呼吸雜志，1995,18（6）：377.7賴新生,唐純志,楊君軍,等，穴位敷貼對哮喘豚鼠血清E、P選擇素水平的影響J.針刺研究,2005,30（4）：219.8錢小順.哮喘嗜酸性粒細胞凋亡的調(diào)控J.國外醫(yī)學：呼吸系統(tǒng)分冊，2000, 20（1）： 6.9Jonas S Erjefalt, Carl G A Rersson.New aspects of egranulation and fates of airway mucosal eosinophilsJ.Am J