芷香豆素的鎮(zhèn)痛作用部位及其機制

1、芷香豆素的鎮(zhèn)痛作用部位及其機制    【摘要】  目的 觀察白芷香豆素(Coumarin of Angelicae Dahuricae，CAD)的鎮(zhèn)痛作用部位及其機制。方法 利用小鼠福爾馬林實驗及側(cè)腦室注射CAD對小鼠熱板痛反應(yīng)潛伏期的影響以分析CAD的鎮(zhèn)痛作用部位;觀察CAD對甲醛所致傷害性疼痛模型小鼠血清一氧化氮(NO)和腦組織中內(nèi)啡肽(EP)含量的影響。結(jié)果 CAD(30，60，120 mg/kg)不同程度地抑制了小鼠福爾馬林實驗第一和第二時相反應(yīng)。側(cè)腦室注射CAD(6 mg/kg)明顯延長小鼠熱板痛反應(yīng)潛伏期。CAD(30，60，120

2、 mg/kg)連續(xù)給藥4 d，使甲醛所致傷害性疼痛模型小鼠血清NO含量和腦中EP含量明顯下降。結(jié)論 CAD對物理、化學等傷害性刺激具有明顯鎮(zhèn)痛作用，作用部位可能既在中樞也在外周，鎮(zhèn)痛機制可能與抑制NO的合成或釋放有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  白芷香草醛;鎮(zhèn)痛作用;一氧化氮;內(nèi)啡肽Studies on analgesic site and mechanisms underlying of Coumarins of Angdicae DahuricaeWANG HaiLi，WANG ChunMei，LI He,et al.Digestive System Department of Affili

3、ated Hospital of Beihua University，Jilin 132001，Jilin，China【Abstract】 Objective To observe analgesic site and mechanisms underlying of Coumarins of Angdicae Dahuricae (CAD).Methods The antinociceptive site of CAD was analysed with mice formalin test and mice hotplate test after intracerebroventricul

4、ar (icv) administration;the concentration of nitric oxide (NO) in serum and EP in brain of mice were measured with nitric reductase method and radioimmunoassay (RIA) respectively.Results CAD (30，60，120 mg/kg) reduced the first and secondphase responses of mice formalin test compared with control gro

5、up.After one time icv administration of CAD(6 mg/kg) for mice，hotplate latency were significantly prolonged.The concentration of NO in serum and EP in brain of mice induced by formalin were both decreased.Conclusions CAD could induce definite analgesic effect，which may be related to central and peri

6、pheral mechanisms.【Key words】 CAD;Antinociceptive effect;NO;EP白芷具有散風除濕、通竅止痛、消腫排膿的功效;用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻淵、牙痛、瘡瘍腫痛等有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)1，2。白芷的有效成分有白芷香豆素(CAD)、揮發(fā)油等，揮發(fā)油成分在白芷中的含量甚微，且白芷經(jīng)硫熏后含量大大下降3。香豆素類成分在白芷中含量遠較揮發(fā)油高，可達1%左右，本課題組前期工作證實CAD具有良好的鎮(zhèn)痛及抗炎作用4，為將該藥開發(fā)為鎮(zhèn)痛新藥。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，初步確定CAD的鎮(zhèn)痛作用部位，檢測甲醛所致傷害性疼痛模型小鼠血清NO和腦組織中EP的含量，進一步

7、探討CAD的鎮(zhèn)痛作用機制，為開發(fā)新的鎮(zhèn)痛作用可靠，副作用小，無成癮性的中藥鎮(zhèn)痛劑奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 動物、儀器及藥品 昆明種小鼠，體重1822 g，雌雄各半，由吉林大學動物實驗研究中心提供，合格證號：醫(yī)動管字 105107。小鼠熱板儀，成都泰盟生物技術(shù)有限公司;電子天平(SARTOR2US，BP211D)，西德;低溫離心機，日立CR21;801離心機，上海手術(shù)器械廠;FSH2組織勻漿機，江蘇金壇市一通電子有限公司;723分光光度儀，上海第三分析儀器廠;放射免疫自動分析儀，北京核海高科技公司。CAD由北華大學藥理教研室配制。鹽酸嗎啡注射液，沈陽第一制藥廠，批號：011108;甲醛溶液

8、，長春市化學試劑廠，批號：20040224;伊文思藍，美國Sigma公司產(chǎn)品;NO試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供，批號：20061221;內(nèi)啡肽放射免疫測定盒，由北京海科銳生物技術(shù)中心提供，批號：070115。1.2 福爾馬林致痛法5 小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，分別為對照組、嗎啡組、阿司匹林組、CAD低、中、高劑量組。嗎啡組和阿司匹林組腹腔注射(ip)給藥后0.5 h，其余各組ip給藥后2 h，每鼠右后足跖皮下注射0.25%福爾馬林10 l。分別記錄注射后05 min(第一時相)和1530 min(第二時相)小鼠舔或抖被注射足的累計時間，以秒(s)為計算單位。1.3 小鼠側(cè)腦室

9、注射法6 小鼠40只，隨機分為4組，分別為對照組、嗎啡組、CAD組、CAD同容積腹腔注射組。固定小鼠后，使用10 l微量注射器，針頭外連細長硬塑料管，硬塑料管接4號針頭，使針尖部露出約2.5 mm的進針長度，于兩耳前緣線與矢狀線交點處的前、外各2 mm處進針注射0.5%伊文思藍生理鹽水溶液，注射容積10 l，時間5 s，留針10 s，處死小鼠，解剖觀察伊文思藍是否進入腦室，以確定注射部位。按上述方法進行小鼠側(cè)腦室給藥，然后以熱板法分別測定給藥后5、15、30、45、60 min小鼠痛閾，觀察鎮(zhèn)痛效應(yīng)。1.4 CAD對甲醛所致傷害性疼痛模型小鼠血清NO含量和腦EP含量的影響 小鼠50只，雌雄各半

10、，隨機分5組，分別為陰性對照組、嗎啡組、CAD低、中、高劑量組，每天分別腹腔注射，連續(xù)4 d(嗎啡組除外)，末次給藥后(1.5 h后陽性組 腹腔注射嗎啡10 mg/kg)2 h，每只鼠右后足跖皮下注射0.25% 甲醛溶液20 l，2 h后處理7。將小鼠快速斷頭取血，分離血清，-20冰箱保存待測。小鼠頭部立即于冰臺上分離全腦，投入沸生理鹽水中煮4 min，取出濾紙吸干、稱重，制備10%腦組織勻漿，取上清液貯存于-20保存。采用硝酸還原酶法和放射免疫學方法分別測定血清中NO含量和腦組織中EP的含量，具體步驟說明書。1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.1軟件進行兩組間t

11、檢驗和多組間方差分析。2 結(jié) 果2.1 CAD對小鼠福爾馬林實驗的影響 小鼠一次性腹腔注射給藥CAD 30，60，120 mg/kg，與對照組比較，CAD中、高劑量組使福爾馬林實驗第一時相內(nèi)舔或抖注射足累計時間明顯減少(P<0.01),3個劑量組均使第二時相內(nèi)舔或抖注射足累計時間明顯減少(P<0.05或P<0.01)。表明CAD既抑制福爾馬林實驗小鼠的第一時相反應(yīng)，也明顯抑制第二時相反應(yīng)。陽性對照藥鹽酸嗎啡同時抑制第一時相和第二時相的反應(yīng)，阿司匹林僅抑制第二時相的反應(yīng)而對第一時相沒有影響。見表1。2.2 CAD側(cè)腦室給藥對小鼠熱板痛反應(yīng)的影響 CAD 6 mg/kg側(cè)腦室給藥

12、能明顯延長痛反應(yīng)潛伏期(P<0.05)，給藥后15 min開始顯效(P<0.01)，可持續(xù)到90 min以上(P<0.01)，而相同劑量ip則對痛反應(yīng)潛伏期無明顯影響。嗎啡組給藥后立即開始顯效(P<0.001)，在515 min效應(yīng)最顯著(P<0.001)，并可持續(xù)到90 min以上(P<0.05)。見表2。表1 各組小鼠福爾馬林實驗的舔或抖注射足累計時間的比較表2 CAD 側(cè)腦室給藥對小鼠熱板痛反應(yīng)的影響2.3 CAD對甲醛所致傷害性疼痛模型小鼠血清NO含量和腦中EP含量的影響 與對照組比較，CAD(60 mg/kg)連續(xù)4 d腹腔注射給藥，中、高劑量組均

13、使小鼠血清中NO和腦組織中EP的含量下降(P<0.01或P<0.001)，并且呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。而嗎啡組血清中NO和腦組織中EP的含量明顯上升(P<0.01或P<0.05)。見表3。表3 CAD 對小鼠血清 NO和腦中EP含量的影響3 討 論福爾馬林實驗可初步了解受試藥物的歸類和作用部位。向動物足底部皮下注射1%5%的福爾馬林溶液，觀察注射足的反應(yīng)并記錄不同時相反應(yīng)的累計時間作為疼痛指標。嗎啡類鎮(zhèn)痛藥能抑制本法產(chǎn)生的第一、第二時相反應(yīng)，而抗炎鎮(zhèn)痛藥只抑制第二時相反應(yīng)。本實驗結(jié)果表明CAD 即抑制福爾馬林實驗小鼠的第一時相反應(yīng)，也明顯抑制第二時相反應(yīng)，不僅進一步說明

14、CAD 具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，同時也提示了CAD 的鎮(zhèn)痛作用部位可能既在中樞也在外周。CAD側(cè)腦室給藥實驗進一步提示其鎮(zhèn)痛作用部位可能在中樞。NO作為一種重要的生物活性分子，在中樞及外周的不同痛覺調(diào)制中起重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性NO水平的降低表現(xiàn)一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)5。而在外周痛覺的調(diào)制中，認為抑制NO的合成可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。本研究結(jié)果表明CAD的鎮(zhèn)痛作用與其抑制NO合成有關(guān)。由于本實驗利用的是小鼠疼痛模型，未能檢測局部組織中的NO含量，如能觀察藥物對局部組織中NO產(chǎn)生和釋放的影響，將更有助于我們理解其鎮(zhèn)痛作用。EP是一種神經(jīng)內(nèi)分泌遞質(zhì)，屬于內(nèi)源性阿片肽(endogenous opioid peptides，EOP)的一種，在體內(nèi)起著痛覺感受的調(diào)控或與阿片受體結(jié)合產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)的作用，是目前公認的對疼痛進行調(diào)整的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。本研究結(jié)果顯示CAD 低、中、高組劑量依賴性降低小鼠腦組織中EP含量。這可能由于CAD 促進EP釋放而引起組織含量降低，而嗎