香豆雌酚對新生大鼠成骨細胞增殖分化的影響(一)

1、香豆雌酚對新生大鼠成骨細胞增殖分化的影響(一)    作者：韋繼南,吳小濤,陳曉剛,王斌【摘要】 目的：觀察香豆雌酚對大鼠成骨細胞(OBs)增殖分化的影響，初步探討香豆雌酚對OBs的作用機制。方法：用不同濃度香豆雌酚干預(yù)OBs，根據(jù)不同時間分別用酶消化法測堿性磷酸酶活性和羥脯氨酸含量、放免法測骨鈣素含量及半定量RTPCR法檢測OBs內(nèi)OPG/RANKL基因的表達。 結(jié)果:香豆雌酚呈濃度和時間依賴性促進大鼠OBs增殖及堿性磷酸酶表達;干預(yù)12h，各濃度組羥脯氨酸含量呈濃度依賴性增高，其中10-8mol·L-1作用最大(P=0.022)；培養(yǎng)12h

2、，OBs表達骨鈣素呈濃度依賴性，24h達高峰，其中10-8mol·L-1有顯著性差異(P=0.012)，48h有所下降；不同濃度、時間組香豆雌酚均能促使OBs增加表達OPG mRNA，同時有抑制RANKL mRNA表達的作用，其在24h 10-8mol·L-1濃度作用強度最大(P=0.038)，10-5mol·L-1則呈現(xiàn)抑制作用。結(jié)論:香豆雌酚能促進OBs的增殖分化，其作用呈濃度和時間依賴性，且至少部分有OPG/RANKL途徑的參與。 【關(guān)鍵詞】 香豆雌酚；成骨細胞；護骨素；骨質(zhì)疏松；大鼠雌激素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用，絕經(jīng)后雌激素替代療法

3、(hormone replacement therapy,HRT)曾被認為是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療的金標準，但隨著HRT所帶來的陰道出血、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等風(fēng)險大大限制了其臨床推廣應(yīng)用1。近年來植物雌激素(phytoestrogen,PE)備受關(guān)注，它們的結(jié)構(gòu)類似于17雌二醇，能預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，但對子宮和乳腺無刺激作用2。動物實驗表明，PE香豆雌酚能減少去卵巢大鼠骨丟失和骨吸收，增加骨密度3,有研究報道香豆雌酚能抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞分化成熟及骨吸收活性4，但其具體機制尚不清楚，對成骨細胞的作用也未見報道。為觀察香豆雌酚對成骨細胞的直接作用，本實驗擬用香豆雌酚干預(yù)體外培養(yǎng)的新生大

4、鼠成骨細胞，觀察其對成骨指標的影響，初步探討其對骨代謝的作用及其機制。1 材料和方法1.1 主要材料新生SD大鼠（東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供）,LGDMEM(Gibco BRL),FBS(杭州四季青),ALP染色試劑盒(南京建成生物研究所),骨鈣素試劑盒(北京科美東雅公司),TRIzol(Katara Ltd.),RTPCR kit(MBI Ltd.),型膠原酶、胰酶、MTT、DMSO、Coumestrol、Estradiol(Sigma Ltd.USA),其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 細胞培養(yǎng)1.3 觀察指標100，反復(fù)吹打后1000r·min-1離心3min，酶消化法測上清

5、液中堿性磷酸酶的含量。100，反復(fù)吹打后1000r·min-1離心3min，放免法測上清液中骨鈣素的含量。actin基因，引物序列及擴增條件見表1(引物由上海生工生物工程有限公司合成)。PCR擴增產(chǎn)物于1.5瓊脂糖進行凝膠電泳、EB染色和拍照，并用Image master VDS成像系統(tǒng)行條帶光密度分析。表1 各基因引物序列及擴增條件擴增基因2 結(jié) 果2.1 成骨細胞鑒定2.2 香豆雌酚對成骨細胞增殖和分化的影響PCR分析表明，香豆雌酚呈濃度和時間依賴性促進成骨細胞OPG/RANKL基因表達，10-8mol·L-1干預(yù)24h顯著增加OPGmRNA表達(P=0.015)，抑制

6、RANKL基因表達(P=0.038)，OPG/RANKL顯著升高；高濃度(10-5mol·L-1)香豆雌酚對OPG基因表達有抑制作用(P0.05)3 討論PE分為異黃酮類(isoflavones)、木酚素類(lignans)和香豆素類(coumestans)。香豆雌酚是香豆素類的一種，廣泛存在于三葉草和卷心菜中。流行病學(xué)資料表明，食用富含PE食物的亞洲人，乳腺癌、前列腺癌及骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)病率較白種人低6；Dodge等發(fā)現(xiàn)香豆雌酚能有效地緩解切除卵巢大鼠的骨質(zhì)減少，能使大鼠骨質(zhì)密度恢復(fù)到與未切除卵巢大鼠相近的水平7；在器官培養(yǎng)中，香豆雌酚具有雌激素效能，可增加雞胚股骨培養(yǎng)中鈣含量

7、8，有人研究發(fā)現(xiàn)香豆雌酚類似物KCA098能促進成骨細胞的分化，提高堿性磷酸酶活性，增加鈣磷含量9，然而，其對成骨細胞作用的機制仍然未明。本實驗中MTT結(jié)果表明，各濃度香豆雌酚對成骨細胞的增殖在培養(yǎng)12、24和48h都有一定促進作用，其中又以10-8和10-9mol·L-1作用24h時最強，而高濃度(10-5mol·L-1)香豆雌酚反而出現(xiàn)了抑制作用(圖3)，由此可見高濃度香豆雌酚可能抑制細胞增殖。此外，我們從成骨細胞分化的指標堿性磷酸酶、骨鈣素及羥脯氨酸來說明香豆雌酚對成骨細胞分化的影響。堿性磷酸酶、骨鈣素分別是成骨細胞早期和晚期分化的指標。本實驗中各濃度香豆雌酚干預(yù)成骨

8、細胞12、24和48h均輕度增加堿性磷酸酶表達，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0061)；10-8mol·L-1香豆雌酚作用24h能顯著增加成骨細胞內(nèi)骨鈣素表達，有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012)。該結(jié)果提示香豆雌酚可能影響成骨細胞分化的晚期階段。羥脯氨酸在型膠原中占有恒定的比例，本實驗中我們通過檢測羥脯氨酸含量反映型膠原的表達情況。結(jié)果表明，各濃度香豆雌酚干預(yù)12h，各組培養(yǎng)液上清羥脯氨酸含量呈濃度依賴性增高,10-8mol·L-1顯著增高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022)；干預(yù)24和48h，培養(yǎng)液上清羥脯氨酸含量僅輕度增高，無統(tǒng)計學(xué)意義。近年來的分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素的作用還與成

9、骨細胞和破骨細胞的分子間對話機制(crosstalk)有關(guān)10。破骨細胞膜上存在一種跨膜蛋白RANK(receptor activator of nuclear factor )，而成骨細胞膜上存在一種RANK的配體RANKL (receptor activator of nuclear factor ligand)，它也是一種跨膜蛋白。雌激素缺乏使得RANKL與RANK結(jié)合，就會產(chǎn)生RANKL/RANK/NF信號級聯(lián)反應(yīng)，促使破骨細胞活化11。另一方面，成骨細胞還能自分泌一種被稱為骨保護素的蛋白質(zhì)，它作用的靶分子就是自身細胞膜上的RANKL，因此也被稱為偽受體（decoy receptor）

10、12。雌激素能促進骨髓基質(zhì)細胞、成骨細胞OPG mRNA的表達，當(dāng)OPG與RANKL結(jié)合后，即阻斷RANKL與破骨細胞膜上的RANK結(jié)合，從而結(jié)束成骨細胞與破骨細胞之間的對話，使破骨細胞內(nèi)NF的信號下傳中斷，抑制破骨細胞的活化和溶骨過程。本實驗中RTPCR分析表明，各濃度香豆雌酚對成骨細胞OPG/RANKL基因表達呈濃度和時間依賴性，10-8mol·L-1干預(yù)24h能顯著增加成骨細胞OPG基因表達(P=0.015)，與對照組17Estradiol相當(dāng)，同時顯著抑制RANKL的表達(P=0.038);OPG/RANKL顯著升高。低濃度(10-1010-8mol·L-1)香豆雌

11、酚對RANKL基因表達作用不大。Bord等報道雌激素可有效刺激人成骨細胞OPG/RANKL mRNA和蛋白表達,且呈濃度和時間依賴關(guān)系13。綜上所述，本實驗結(jié)果初步表明，PE香豆雌酚能促進成骨細胞增殖分化，其作用至少是部分通過OPG/RANKL途徑而發(fā)揮的。然而，目前對香豆雌酚的研究甚少，對其作用的機理研究尚缺乏充分的實驗依據(jù)，這也是我們今后努力的方向。【參考文獻】1STAREN E D,OMER S.Hormone replacement therapy in postmenopausal womenJ.Am J Surg,2004,188(2):136149.2SETCHELL K D,LYDEKINGOlLSEN E.Dietary phytoestrogens and t