ELISA方法在基礎醫(yī)學研究中的應用分享

1、真誠為您提供優(yōu)質參考資料，若有不當之處，請指正。ELISA方法在基礎醫(yī)學研究中的應用來源：aaanearlwaaa1. ELISA的基本原理ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合的一種具有高特異性和高敏感性的實驗技術，幾乎所有的可溶性抗原一抗體系統(tǒng)均可用以檢測，它的最小可測值達ng甚至pg水平。該方法的基本原理如下：(1)將抗原或抗體結合到某種固相載體(目前以聚苯乙烯微量滴定板最為常用)表面，并保持其免疫活性。此步驟稱為“固相載體的包被”，在商品化試劑盒中均已完成。(2)再將抗原或抗體與某種酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)連接成酶標抗原或酶標

2、抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。檢測時，按相應順序加入待檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或酶標抗體，使其與固相載體上的抗原或抗體發(fā)生反應。以洗滌的方法洗去各步驟中過量的未結合物質，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。(3)最后加入酶反應的底物，底物即被酶催化生成有色產(chǎn)物，而有色產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺進行定量分析。此種顯色反應可通過酶標儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。2. ELISA技術在臨床醫(yī)學研究中的應用ELIS

3、A步驟復雜，試劑制備困難，只有應用符合要求的試劑和標準化的操作，才能獲得滿意的結果。目前應用較廣的檢測項目一般均有試劑盒出售，完整的ELISA試劑盒應包含已包被好的固相載體、酶結合物、底物和各種濃縮的稀釋液、緩沖液等。在醫(yī)學研究中，ELISA試劑檢測的項目主要可分為以下幾類：(1)各種病原體及其抗體的檢測：如肝炎病毒、巨細胞病毒、風疹病毒、皰疹病毒、艾滋病病毒等；(2)蛋白質：腫瘤標志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等；激素如HCG、FSH、TSH等；細胞因子如TNF0l、VEGF、NFKB等；載脂蛋白如Apo AI、ApoE等；(3)非肽類激素：如T3、rr4、雌二醇、皮質醇等；(4)檢測血液中的藥物

4、濃度：如治療心臟病的藥物地高辛、抗癲癇藥物茶堿、抗生素慶大霉素等 。用于基礎研究的標本來源多種多樣，如臨床血液標本，實驗動物的血液標本，實驗動物的組織標本，培養(yǎng)的細胞以及細胞培養(yǎng)上清等，均可作為待測樣本用于檢測其中某種物質的含量。具體應選取何種樣本進行特定指標的檢測，取決于實驗研究的目的以及待測物質的表達特性。3. ELISA在基礎醫(yī)學研究中的應用特點ELISA方法在基礎研究中的應用與其在臨床檢驗工作中具有很大不同，區(qū)別之處主要如下：(1)基礎研究中ELISA檢測所用標本來源廣泛，涉及人、大鼠、小鼠、兔、豬、犬等多種常用實驗動物種屬的血液、組織、細胞及細胞培養(yǎng)上清液等，而臨床檢驗所用標本則以人

5、的血液(血清或血漿)和尿液等為主；(2)基礎研究具有探索性，其結果也具有不確定性，沒有正常值范圍而言，需要根據(jù)ELISA檢測指標的具體數(shù)值判斷不同實驗組間樣品測定值的意義；而臨床檢驗的ELISA檢測結果具有陽性或陰性的界定，或者存在正常值范圍作為判讀測定結果的標準。(3)對于臨床檢驗標本如血清和血漿而言，各種指標的ELISA檢測試劑盒均會給出對待測樣品的最佳稀釋倍數(shù)；而在基礎研究中，尤其當所測指標是在組織中表達時，即待測樣品來源于組織時，ELISA檢測試劑盒通常不會推薦對待測樣品的稀釋倍數(shù)；此時，研究者必須先通過預實驗摸索出一個最佳稀釋倍數(shù)之后再進行檢測，因此，對組織樣本的檢測步驟較為復雜和繁

6、瑣。4. ELISA的分類及主要操作流程ELISA方法既可用于測定抗原，也可用于測定抗體。根據(jù)樣本中待測物質的種類及性質不同，可以設計出各種不同類型的檢測方法。臨床檢驗工作中用到的ELISA方法主要分為以下幾種類型：(1)用于檢測抗原的：雙抗體夾心法和競爭法；(2)用于檢測抗體的：雙抗原夾心法、間接法、競爭法及捕獲包被法等。然而，在基礎醫(yī)學研究中，涉及到的檢測指標大多數(shù)為抗原性物質，因此，下文僅就雙抗體夾心法和競爭法這兩種測定抗原性物質的方法進行詳細說明。41 雙抗體夾心法檢測抗原研究表明，充血性心力衰竭患者循環(huán)及組織中自介素一6(interleukin-6，IL-6)升高，持續(xù)過度的IL-6

7、產(chǎn)生會破壞細胞因子網(wǎng)絡并可能導致心肌損傷及功能障礙的進展，因此，循環(huán)IL-6水平與左室功能障礙的嚴重程度密切相關。在此，以檢測大鼠血漿IL-6為例說明雙抗體夾心法的ELISA操作步驟和要點。411 操作流程(1)取出試劑盒，置室溫平衡30min；(2)按照說明書要求配制各種工作液：洗液、標準品稀釋液及樣品稀釋液等；(3)根據(jù)說明書推薦的樣品稀釋度對待測樣品進行稀釋，同時按照說明書要求配制各濃度的標準品(從空白對照至低濃度一直到高濃度共設8個濃度梯度)；(4)加標準品和樣品：分別在標準品孔和樣品孔加入標準品和樣品各50 L孔，貼上封板膜，室溫孵育2h；(5)洗板：棄去孔內液體，在吸水紙上輕拍將孔

8、內液體拍干，每孔加洗液3001L，每次浸泡1 min，共如此重復洗4次；(6)加酶標記的抗體：每孔加酶標記抗體100IzL，室溫孵育2h；在此孵育等待期間打開酶標儀，預先建立相應的檢測程序；(7)洗板：重復(5)中的步驟；(8)加酶的底物：每孔加lOOp,L酶底物溶液，室溫避光孵育30 min(30 min內，肉眼觀察可見標準品孔從低濃度至高濃度的淡藍色逐漸加深，至高濃度的34孔呈現(xiàn)明顯的梯度藍色，而低濃度的34孔梯度不明顯時，即可終止)；(9)終止反應：每孔加100mL終止液，此時藍色立即轉為黃色；(10)讀數(shù)：加終止液后1015rain以內在酶標儀的450nm波長測量各孔的光密度值(使用步

9、驟(6)中預先建立的檢測程序)。412 雙抗體夾心法檢測大鼠血漿IL-6的標準曲線在多功能酶標儀(所用儀器：TECAN，GENios plus)中的檢測程序設定步驟中，可以詳細設定標準曲線上各點的濃度數(shù)值和樣品的稀釋倍數(shù)，因此，在最終輸出檢測數(shù)據(jù)時，程序軟件能夠根據(jù)標準曲線上各點的OD值及其對應的濃度，將樣品的OD值自動轉換計算出相應的濃度，檢測便捷、直觀且結果準確。42 競爭法檢測抗原性物質競爭法檢測抗原的步驟與雙抗體法大致相似，不同之處如下：雙抗體夾心法檢測抗原時，先加入待檢樣品使之與固相載體上包被的抗體進行反應，完成特異性結合反應后洗去未結合的抗原，然后加入酶標記的第二抗體，使之與固相載

10、體上的抗原繼續(xù)反應形成夾心式復合物，對該夾心復合物上的標記物進行測定，即可得到待測樣品中抗原的含量；而在競爭法檢測抗原的過程中，是將待檢樣品和一定量的標記抗原同時加入，使二者與固相載體表面有限的抗體進行競爭反應，反應一段時間后洗去游離的抗原，由于競爭反應的結果，使結合在固相載體上的標記物的量與樣品中抗原的量成反比，由此可測定樣品中抗原的含量。Apo AI占高密度脂蛋白(HDL)的67 ，能促進高密度脂蛋白的成熟 。43 雙抗體夾心法與競爭法檢測抗原的主要區(qū)別(1)雙抗體夾心法適用于檢測蛋白質等大分子抗原，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶標記抗體。而小分子抗原

11、或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，不能形成兩位點夾心，故通常選擇競爭法模式檢測。(2)標準曲線的特點不同。在雙抗體夾心法中，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢抗原(或抗體)的量成正比，因此，樣品的吸光度值(OD值)與濃度呈正比，標準曲線如圖3所示。然而，在競爭法中，標本中的抗原和一定量的酶標抗原與固相抗體競爭結合，也就是說，標本中抗原含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。因此，樣品的吸光度值(OD值)與濃度呈反比。5. ELISA試驗的注意事項51 如何訂購試劑盒目前用于基礎研究的EL1SA試劑盒有別于臨床檢驗所用試劑盒，不可用于醫(yī)學診斷，而僅能用于研究。當確定了待測

12、指標后，需要根據(jù)樣本的種屬來源購買相應種類的試劑盒。然后，根據(jù)待測樣品數(shù)量計算所需試劑盒的數(shù)量。以最為常用的96孔酶標板為例，每塊板均需做標準曲線，一般情況標準曲線設6至8個不同的濃度值，若按照8個點計算，每個樣品均需做復孔，則每塊板可以檢測的樣品數(shù)量最多為40個。用待測樣品數(shù)量除以40即是所需購買試劑盒的數(shù)量。在訂購ELISA試劑盒之前還要注意一點：某些試劑盒說明書中要求樣品的前期處理必須使用同一公司生產(chǎn)的特定配套試劑，因此，如果測定組織中某個指標的含量時，需要用到相應的組織蛋白提取試劑及蛋白濃度檢測試劑，這種情況下，應盡量按照說明書要求提前將所有相關試劑購買完全，以免延誤實驗。52試劑盒在

13、使用前需要先從冰箱中取出，在室溫平衡30min左右再用于檢測。53 標本的采集與保存采集血清樣品時，需將全血標本于室溫放置2h或4過夜后，離心分離出上清即可檢測，或將上清置于_20C或以下保存以備用。為避免反復凍融導致血清中待測物質降解，需適量分裝血清后再凍存。若需用血漿樣品進行ELISA檢測，則可將抗凝劑(如EDTA、肝素或枸櫞酸鈉等)加入血液標本，在30min內離心分離上清檢測或分裝凍存?zhèn)溆?。對于細胞培養(yǎng)上清，需要在1000rpm離心5min，取上清用于檢測，目的是為了去除混懸在其中的漂浮細胞。進行ELISA測定之前，需要按照相應說明書要求，對樣品進行稀釋之后用于檢測。54 樣品的稀釋倍數(shù)

14、當待測樣品為血清或血漿時，ELISA檢測試劑說明書通常會給出建議的稀釋倍數(shù)，便于操作。較為復雜和繁瑣的情況是檢測組織樣本中某種物質的定量表達。任何ELISA試劑說明書都不會說明一個關鍵的問題，那就是：從組織樣本中提取蛋白之后，以多大倍數(shù)對樣品進行稀釋后最適宜檢測?因為待測物質在不同組織中的表達豐度可能不一樣；同時，對于不同的研究者而言，即便用同種組織進行檢測，如果對組織的勻漿或裂解的程度不同的話，所提取的蛋白濃度自然就不相同，因此，對樣品的稀釋倍數(shù)就會存在差異。這種情況下，研究者必須首先提取組織蛋白上清，并測定出蛋白濃度，然后結合文獻所報道的待測物質在該組織中的濃度值(一般為每克組織蛋白中所含

15、待測物質的質量)，對蛋白上清的稀釋倍數(shù)進行估算。然后在此估算的稀釋倍數(shù)基礎上，還需要以該稀釋倍數(shù)為中心，另設23個稀釋度，通過預實驗摸索出最佳稀釋倍數(shù)，最后再進行正式實驗。55 抗凝劑的選擇對于某些特殊的檢測指標，為了使測定結果準確可靠，需要了解相關的知識。例如，用血漿樣品進行脂蛋白分析時，需要注意抗凝劑的選擇。由于枸櫞酸鈉和氟化鈉等低分子量抗凝劑的低滲效應，使得大量水分子進入血漿造成血漿成分的稀釋。而二價陽離子螯合劑EDTA，因其分子量較大，產(chǎn)生的低滲效應小，對血漿蛋白濃度影響很小，僅降低3或4 ；肝素比EDTA的分子量更大，其在產(chǎn)生抗凝作用的濃度時未檢測到對血漿的稀釋效應。因此，EDTA和

16、肝素均可用作脂蛋白分析研究的抗凝劑；同時，由于EDTA能抑制在血漿凍存過程中發(fā)生的氧化反應和酶組分的改變，故在實際操作中EDTA是最常用的抗凝劑。用于基礎研究的ELISA試劑盒，在說明書中一般都會推薦該檢測指標需使用的抗凝劑，取血液標本之前要注意查看。56 其他需要準備的儀器及耗材除了酶標儀之外，還用到的儀器有酶標板專用控溫搖床、37C孵箱和漩渦混勻器等，需根據(jù)不同試劑盒操作要求而選擇使用。此外，各個量程的移液器、一次性吸頭、吸水紙、乳膠手套、燒杯和量筒、去離子水、冰盒、試管及離心管等。在檢測開始之前應準備好以上所有物品放置于手邊，以使檢測過程順利進行。57 ELISA操作要點在ELISA操作

17、中有以下幾個步驟較為關鍵：(1)加樣：加樣要準確，試劑應垂直滴加，不得傾斜、人為的加大試劑量。使用一次性吸頭，防止交叉污染。定期校準加樣器。標本應加在微孔底部，避免加在孔壁上部，并注意不要濺出及產(chǎn)生氣泡。(2)溫育：96孔酶標板結構特別，易產(chǎn)生邊緣效應，抗原抗體結合及酶促反應對溫度有嚴格要求，酶標板周圍孔與內部孔的升降溫速率不同，造成周邊與內部孔結果有差異。因此，溫育過程中應該用封板膜封閉整塊板，盡量避免邊緣效應的產(chǎn)生。溫箱溫度必須嚴格控制，溫育時間也應按說明書規(guī)定力求準確。(3)洗板：冼滌是ELISA操作的重要環(huán)節(jié)，手洗條件一致性較差，對結果影響較大，半自動與全自動洗板機使用不當也會影響結果。洗滌時確認洗液注滿每個板孔，但不可溢出板孔，棄液后將孔內液體在吸水紙上拍干。為了洗滌效果更好，實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌后再進行人工洗板1-2次，或適當增加洗板的次數(shù)。(4)顯色終止：顯色時間應嚴格按說明書的規(guī)定。應在顯色終止15min內進行酶標儀讀取。58 使用全自動多功能酶標儀建