實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定課件

1、實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定( (一一) )基本原理基本原理 分光光度法是利用物質(zhì)對某種波長的光具有分光光度法是利用物質(zhì)對某種波長的光具有的的特性建立起來的鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項(xiàng)技術(shù)。特性建立起來的鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項(xiàng)技術(shù)。 Lambert-Beer定律，吸光度與溶液的濃液成正比，與光束通定律，吸光度與溶液的濃液成正比，與光束通過溶液的距離過溶液的距離(即光程即光程)成正比，用數(shù)學(xué)表達(dá)式表示為：成正比，用數(shù)學(xué)表達(dá)式表示為： C：物質(zhì)的濃度，：物質(zhì)的濃度，L：光程（：光程（cm），），K為吸光系數(shù)或消光系數(shù)。為吸光系數(shù)或消光系數(shù)。實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量

2、測定根據(jù)根據(jù)Lambert-beer定律：定律： 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管：As=KLCs (下標(biāo)下標(biāo)S：標(biāo)準(zhǔn)液：標(biāo)準(zhǔn)液) 待測管：待測管：Ax=KLCx (下標(biāo)下標(biāo)X：待測液：待測液)L相等，溫度相同，測定同一物質(zhì)，所用單色光相同，則相等，溫度相同，測定同一物質(zhì)，所用單色光相同，則K相同，則：相同，則： As/Ax=Cs/Cx即即Cx=Ax/AsCs在實(shí)際操作中，常使待測管體積與標(biāo)準(zhǔn)管體積相等在實(shí)際操作中，常使待測管體積與標(biāo)準(zhǔn)管體積相等(以以X代表測定管含量，代表測定管含量，S代表標(biāo)準(zhǔn)管含量代表標(biāo)準(zhǔn)管含量)則：則： 計算待測溶液濃度時，可根據(jù)測定時計算待測溶液濃度時，可根據(jù)測定時的的和和將上式演變?yōu)椋?/p>

3、將上式演變?yōu)椋?待測溶液濃度待測溶液濃度實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定 (1) (1) 又叫做又叫做。從濃度一光密度直線的。從濃度一光密度直線的直線特性，判斷所采用方法的直線特性，判斷所采用方法的。 (2)(2)作作繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可判斷在整個測定過程繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可判斷在整個測定過程中操作、儀器等誤差的大小，確定該中操作、儀器等誤差的大小，確定該。 (3)(3)從繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可以比較各種方法的從繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率可以比較各種方法的。 (4)(4)大批樣品分析時，大批樣品分析時，從光密度值直接查閱，從光密度值直接查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線而求得被測物質(zhì)的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線而求得被測物質(zhì)的濃度。實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定

4、(1) (1) 標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇：標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測樣標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測樣品的可能變異最低與最高值，一般品的可能變異最低與最高值，一般。濃度差。濃度差距最好是距最好是。(2) (2) 標(biāo)準(zhǔn)液的測定：標(biāo)準(zhǔn)液的測定：在比色時，讀取光密度至少讀在比色時，讀取光密度至少讀2-32-3次，求次，求其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。其平均值，以減少儀器不穩(wěn)定而產(chǎn)生的誤差。(3) (3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制：一般常用一般常用。實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定【操作】【操作】試劑試劑標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管測定管測定管空白管空白管1 2 3 4 5 6 7蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液

5、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待測血清樣本待測血清樣本(ml) 1.00.9%NaCl(ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0雙縮脲試劑雙縮脲試劑(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定3 3、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制、標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的繪制 用普通方格紙作圖。圖紙長用普通方格紙作圖。圖紙長寬寬=11=11或長或長寬寬=32=32，以橫軸為濃度，縱軸為光密度。，以橫軸為濃度，縱軸為光密度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)連成一條線。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，將各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)連成一條線。若各點(diǎn)不在一直線，則可若各點(diǎn)不在一直線，則可通過原

6、點(diǎn)通過原點(diǎn)，盡可能使直線，盡可能使直線，使不在直線上的點(diǎn)盡量，使不在直線上的點(diǎn)盡量。座標(biāo)紙上注明：測定物及測定方法的名稱，儀器型座標(biāo)紙上注明：測定物及測定方法的名稱，儀器型號、波長及繪制的日期、室溫。號、波長及繪制的日期、室溫。實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定根據(jù)Lambert-Beer定律，定律， 配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液配制一系列標(biāo)準(zhǔn)液C1、C2、C3，在在 max下，測相應(yīng)的下，測相應(yīng)的A1、A2、A3。實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定 根據(jù)根據(jù)Lambert-Beer氏定律：氏定律：A=KLC 若若C為為1%（g/ml），），L為為1cm，此時的，此時的K值稱為百分吸光值稱為百分吸光系數(shù)用系數(shù)用E1%1cm表示表

7、示.即：即：C=A/E1%1cm 若若，其，其K值稱為值稱為用用表示即；表示即； C=A/實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定 根據(jù)三個原則：根據(jù)三個原則： 1.1.被測溶液有適當(dāng)?shù)墓饷芏?，適當(dāng)?shù)墓饷鼙粶y溶液有適當(dāng)?shù)墓饷芏?，適當(dāng)?shù)墓饷芏葹槎葹?.1- 0.70.1- 0.7，以，以0.2- 0.60.2- 0.6最理想。最理想。 2.2.應(yīng)使干擾影響降低至最低限度。應(yīng)使干擾影響降低至最低限度。 3.3.應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)曲線在盡可能大的范圍內(nèi)接近應(yīng)使標(biāo)準(zhǔn)曲線在盡可能大的范圍內(nèi)接近直線。直線。實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定 雙縮脲雙縮脲(N

8、H(NH2 2CONHCONHCONHCONH2 2) )在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)生成紫紅色化合物，稱為生成紫紅色化合物，稱為雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)。 蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵蛋白質(zhì)分子中含有許多肽鍵(-CONH-)(-CONH-)在堿性溶液中在堿性溶液中也能與也能與CuCu2+2+反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色化合物。在一定范圍內(nèi)，其其。 操作簡便、迅速、受蛋白質(zhì)種類性質(zhì)的影響較??；操作簡便、迅速、受蛋白質(zhì)種類性質(zhì)的影響較??； 靈敏度較差，特異性不高。靈敏度較差，特異性不高。-CONH-CONH2 2、 -CH-CH2 2NHNH2 2、 -CS-N

9、H-CS-NH2 2等基團(tuán)也有此反應(yīng)。等基團(tuán)也有此反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定【操作】【操作】試劑試劑標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)管測定管測定管空白管空白管1 2 3 4 5 6 7蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待測血清樣本待測血清樣本(ml)1.0 0.9%NaCl(ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0雙縮脲試劑雙縮脲試劑(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0實(shí)驗(yàn)二、蛋白質(zhì)定量測定( (一一) )在座標(biāo)紙上以光密度為縱座標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度在座標(biāo)紙上以光密度為縱座標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。( (二二) )從從待測血清樣本的蛋白質(zhì)濃度待測血清樣本的蛋白質(zhì)濃度(g/L)(g/L)，并求出