重組質(zhì)粒的篩選和鑒定李雙男

1、分子生物化學實驗 重組質(zhì)粒的篩選和鑒定 學生姓名李雙男 學號20162012049專業(yè)農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境年級、班級2016級所在學院農(nóng)學院  重組質(zhì)粒的篩選和鑒定摘要：本實驗目的為熟悉互補篩選的原理，并且掌握重組子篩選的方法和重組子鑒定的方法。從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多,本實驗采用試劑盒提取重組DNA。采用PCR擴增檢測法和瓊脂糖凝膠電泳分析進行實驗，得出篩選結果并進行分析討論，提出了對本實驗的展望。關鍵詞：重組質(zhì)粒；PCR；氨芐青霉素；LB培養(yǎng)液0前言為熟悉互補篩選的原理，并且掌握重組子篩選的方法和重組子鑒定的方法。轉(zhuǎn)化體的篩選是利用載體選擇性的遺傳標記，主要是不同抗生素基因篩

2、選。重組質(zhì)粒的鑒定常用-互補、質(zhì)粒酶切、PCR、分子雜交等方法?；パa篩選的原理是載體上LacZ的5端有一段多克隆位點(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ的合成，不能互補1。由于在含抗生素平板培養(yǎng)基上長出的白斑不一定是期望的重組質(zhì)粒，所以重組質(zhì)粒的鑒定。應用PCR擴增檢測法，其原理為PCR能在模板序列上擴增出預期DNA片斷。直接電泳法是利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大的原理。限制性核酸內(nèi)切酶酶切法是根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結果（DNA帶數(shù)和長度）2。是否符合預計的結果。PCR擴增檢測

3、法是根據(jù)PCR能在模板序列上擴增出預期DNA片斷。質(zhì)粒PCR篩選法將菌落PCR篩選法初步鑒定出的單菌落，接種于含有Amp(Kan)的LB培養(yǎng)基中,37搖菌培養(yǎng)過夜，利用堿裂解法（或試劑盒）進行質(zhì)粒的小量提取。獨立于染色體外的，能自主復制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子，是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子稱為質(zhì)粒(Plasmid) 。存在于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多。質(zhì)粒類型總共分為兩種類型，第一種嚴謹型，這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步3。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝；第二種松馳型，這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含

4、有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還會使質(zhì)粒拷貝數(shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達到更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒結構主要有三大要素： 多克隆位點、選擇標記、獨立的復制單位。從大腸桿菌中分離質(zhì)粒DNA方法眾多，目前常用的:堿裂解法、煮沸裂解、羥基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法和酸酚法等4。選擇哪一種方法主要取決于質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株、裂解后用于純化的技術和實驗要求這幾個因素。其中堿變性法既經(jīng)濟且收得率較高,提取的質(zhì)粒DNA可用于酶切,連接與轉(zhuǎn)化，本實驗采用試劑盒提取重組DNA。載體DNA1實驗技術路線外源DNA連接 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導電穿

5、孔或顯微注射重組分子真核細胞受體細胞 原核細胞表達擴增或表達2試驗方案2.1材料氨芐青霉素（Amp）、LB培養(yǎng)液、PCR反應體系、試劑盒、2.2儀器旋渦混合器，微量移液取樣器，離心管，雙面離心管架，水浴鍋，制冰機，搖床，超凈工作臺，培養(yǎng)箱。2.3方法2.3.1 PCR擴增檢測法（1）按配方將所需試劑擺放在實驗桌上（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（3）蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁使其混合（4）將微量離心管放在離心機上瞬時離心5s（5）將離心管放入PCR儀上，設置好PCR儀的循環(huán)程序進行反應參數(shù)2.3.2瓊脂糖凝膠電泳分析反應完畢，取5l擴增產(chǎn)物用1瓊脂糖凝膠進行電泳

6、分析,檢查反應產(chǎn)物及長度。2.3.3 DNA回收純化（1）使用1×TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。（2）在紫外燈下用干凈刀片切下目標帶瓊脂凝膠塊，放入一新離心管中。(注意要在長波長（300nm）UV燈下操作，并快速操作，以免損傷DNA。應盡可能多地去除瓊脂糖凝膠)（3）加500l溶膠液，50水浴10min，中間翻動，直至膠塊完全溶解，降至室溫。（4）將溶液加入離心吸附柱中,12000rpm離心30s,棄掉廢液。（5）加700l 漂洗液，12000rpm離心30 s, 棄掉廢液。（6）加500l 漂洗液，12000rpm離心2min, 棄掉廢液。（7）

7、取出吸附柱，放入一干凈離心管中，加30l洗脫緩沖液溶解。（8）1瓊脂凝凝膠鑒定，貯存DNA片段。3試驗結果 圖1.藍白斑菌落 圖2.電泳 如圖1是藍白斑菌落的篩選結果，結果顯示有菌落的產(chǎn)生。在5個培養(yǎng)皿中有三個有藍白斑出現(xiàn)，證明操作過程沒有存在太大問題。但是，在涂平板的時候有兩個平板可能存在不均勻的情況或者接種的量比較少，所以導致培養(yǎng)皿里沒有培養(yǎng)出來任何菌落。如圖2第三個和第四個孔所示，我們的樣品只出來了一條條帶，另一條沒有出來，最后分析結果顯示可能是因為我們在點樣的時候隔壁組的點樣孔破裂了，導致我們點樣的時候有點飄，所以最終沒有跑出條帶。從這些實驗中可以看出來，我們在操作過程中存在許多不熟練

8、的現(xiàn)象，而且針對樣品使用方面也不太了解，對分子這個現(xiàn)在研究很熱的領域還是很欠缺，需要在今后的研究生涯中去不斷的提高自己。4實驗展望在近幾年的基因工程技術研究過程中，常用的重組質(zhì)粒克隆和空質(zhì)粒細菌的篩選方法有最經(jīng)典的利用a互補原理的藍白斑篩選，還有質(zhì)粒快檢法、菌落PCR、菌落原位雜交、插入失活、限制性內(nèi)切酶酶切反應等等。這些方法或多或少都存在操作繁瑣、耗費資金、使用范圍很窄、假陽性率高等缺點。因此我們需要研究一種新型的質(zhì)粒載體 ，可以更簡單高效、快捷可靠的篩選細菌重組質(zhì)?？寺?。在本實驗中，由于操作問題導致電泳只有一條帶成功。進一步要加強實驗中的操作規(guī)范性，提高做實驗的效率，提高成功率。我的研究

9、方向是棉花脅迫下的生理機制，參考許多文獻將分子生物技術應用于棉花方面的研究6，因此要熟練掌握分子實驗的技術，為以后的科研道路上提供基礎。參考文獻1 陳勇，周光宏，劉紅林.豬_2-AR基因重組質(zhì)粒的快速篩選,生物技術J.2002, 12(5):5-6.2 林俊堂,李玉昌,張會勇等.結合PCR擴增快速篩選鑒定重組質(zhì)粒J.河南師范大學學報(自然科學版),2002,30(3):68-70.3 王麗輝. 前列腺特異性抗原啟動子/增強子重組質(zhì)粒篩選及特異性的體外鑒定D. 蘇州大學, 2014.4 孫樺, 李光明, 劉博偉,等. 靶向bcl-2基因轉(zhuǎn)錄shRNA重組質(zhì)粒的構建和篩選J. 上海交通大學學報醫(yī)學版, 2008, 28(2):224-22