小鼠蛋白激酶CPKC酶聯(lián)免疫分析

1、小鼠蛋白激酶C （PKC ）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。檢測范圍：96T15pmol/L-400pmol/L使用目的：本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關(guān)液體樣本中蛋白激酶C（ PKC）含量。實驗原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中小鼠蛋白激酶C（ PKC）水平。用純化的小鼠蛋白激酶C（ PKC）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入蛋白激酶 C（ PKC），再與HRP標記的蛋白激酶 C（ PKC ）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合 物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作 用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的

2、深淺和樣品中的蛋白激酶C（PKC）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（0D值），通過標準曲線計算樣品中小鼠蛋白激酶C（ PKC）濃度。試劑盒組成130倍濃縮洗滌液20ml X 1 瓶7終止液6ml X 1 瓶2酶標試劑6ml X 1 瓶8標準品(800pmol/L )0.5ml X 1 瓶3酶標包被板12孔X 8條9標準品稀釋液1.5ml X 1 瓶4樣品稀釋液6ml X 1 瓶10:說明書1份5顯色劑A液6ml X 1 瓶11圭寸板膜"張6顯色劑B液6ml X 1/瓶12密封袋1個標本要求1 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能 馬上

3、進行試驗，可將標本放于 -20 C保存，但應(yīng)避免反復凍融2. 不能檢測含 NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。400pmol/L5號標準品150 d的原倍標準品加入150 d標準品稀釋液200pmol/L4號標準品150 d的5號標準品加入150 d標準品稀釋液100pmol/L3號標準品150 d的4號標準品加入150 d標準品稀釋液50pmol/L2號標準品150 d的3號標準品加入150 d標準品稀釋液25pmol/L1號標準品150 d的2號標準品加入150 d標準品稀

4、釋液2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50山,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40山,然后再加待測樣品10 d （樣品最終稀釋度為 5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置 37 C溫育30分鐘。4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30倍稀釋后備用5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50 4，空白孔除外。7. 溫育：操作同3。8. 洗滌：操作同5。9. 顯色：每孔先

5、加入顯色劑 A50 4，再加入顯色劑 B50 4，輕輕震蕩混勻，37 C避光顯色 10分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50 4，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（ OD值）。測定應(yīng)在加終止 液后15分鐘以內(nèi)進行。操作程序總結(jié)：準備試劑，樣品和標準品計算以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式， 將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)， 即為樣品的實際濃度。注意事項1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。 3各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測定，計 算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX 5）O5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6.底物請避光保存。7嚴格按照說明書的操作進