大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展綜述

1、基因工程制藥綜述班級：生技132 姓名： 學號： 大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展綜述自上世紀 70 年代以來, 大腸桿菌一直是基因工程中應用最為廣泛的表達系統(tǒng)。盡管基因工程表達系統(tǒng)已經(jīng)從大腸桿菌擴大到酵母、昆蟲、植物及哺乳動物細胞,并且近年來出現(xiàn)了很多新型的真核表達系統(tǒng), 但是大腸桿菌仍然是基因表達的重要工具。 尤其是進入后基因組時代以來, 有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及功能研究的開展 ,對基因表達的要求更高,這時大腸桿菌往往是表達的第一選擇。文章綜述了近 年來有關(guān)大腸桿菌表達載體及宿主細胞的改造工作。1表達載體1. 1表達調(diào)控構(gòu)建有效的表達載體是表達目的基因的基本要求, 同時也是影響基因表達水平以及蛋白活性的

2、重要因素。標準的大腸桿菌表達載體的主要組成: 啟動子、操縱子、核糖體結(jié)合位點、翻譯起始區(qū)、多克隆位點、終止子、復制起點以及抗性篩選因子等。理想的表達載體要求在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上可以控制目的基因的表達 ,然而目的基因在宿主體內(nèi)過分表達(選用較強的啟動子等)會對宿主造成壓力, 引起相關(guān)的細胞應答反應, 影響蛋白的活性等?；蚪M、 RNA 轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝調(diào)控組等領(lǐng)域的研究成果給我們提供了大量關(guān)于基因表達調(diào)控的信息 1 ?，F(xiàn)已能從基因和細胞的整體水平來方便地選擇合適的啟動子或合 理開發(fā)新的載體系統(tǒng)。譬如 Lee 等利用二維凝膠電泳法比較了重組載體和空載體被分別轉(zhuǎn)入宿主細胞后蛋白組學的差異,發(fā)現(xiàn)兩

3、者都產(chǎn)生了大腸桿菌熱休克蛋白并引起了 cAMPCRP 調(diào)節(jié)蛋白的應答, 其中重組子的影響更為強烈；另外, 還發(fā)現(xiàn)外源基因的表達使宿主核糖體合成速率、翻譯延長因子和折疊酶表達水平、細胞生長率下降 , 而使細胞呼吸活力上升 2 。目前應用的表達載體主要問題是 表達過程中出現(xiàn)的全或無的情況, 通常表達的培養(yǎng)物都是 非純種的細胞群, 其中有一些細胞可以最大限度地被誘導,而另一些細胞在誘導后基因的表達被關(guān)閉。分離具有合適強度啟動子及翻譯速率的載體變種可以優(yōu)化表達水平,說明啟動子的選擇對于基因的誘導表達非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同強度級別啟動子的載體進行互補分析, 可能有助于篩

4、選最為適合的啟動子3 。開發(fā)非 IPTG 或阿拉伯糖誘導的載體也可以提高基因表達水平, Qing 等利用 cspA 基因的獨特性開發(fā)了一系列冷休克表達載體 pCold, 使目的基因在低溫下(15) 誘導表達,提高了產(chǎn)物的溶解性和穩(wěn)定性4 。 1. 2融合表達載體 除了表達載體的調(diào)控性,為了提高蛋白產(chǎn)物的活性以及簡化下游純化的操作等 ,往往在表達載體上插入其它輔助的基因序列與目的基因構(gòu)成融合蛋白表達。融合信號肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表達可以使融合蛋白通過經(jīng)典的 Sec 途徑分泌到周質(zhì)或胞外表達, 有利于形成二硫鍵以及避免胞質(zhì)蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。 另外

5、,最近開發(fā)的雙精氨酸轉(zhuǎn)運體系(Tat)可以有效分泌正確折疊的重組蛋白5 。常見的純化標簽多根據(jù)親和層析的配體來選擇,如 6H is、GST 、CAT 、MBP 等經(jīng)過一步親和純化可以得到均一性較高的產(chǎn)物, 但化學洗脫會對產(chǎn)物的活性產(chǎn)生一定的影響。Ca2+依賴的鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(CBP)和鏈球菌親和素結(jié)合肽(SBP)作為純化標簽時, 只需要在洗脫液中移去標簽依賴的離子或小分子就能實現(xiàn)溫和的特異性洗脫6 ,7 。再者, 應用一些非層析的純化標簽在純化操作中非常經(jīng)濟實用, 如熱敏型的類彈性蛋白多肽 (ELPs)可以使蛋白產(chǎn)物在溶解態(tài)和非溶解態(tài)之間轉(zhuǎn)變, 后續(xù)應用逆轉(zhuǎn)循環(huán)的純化方法可以達到親和純化的回收

6、率8 。另外,在純化標簽與目的蛋白之間插入一些特殊的短肽,同時融合剪切酶可以在純化操作中利用標簽的自剪切直接得到產(chǎn)物蛋白。 例如 SrtAc 酶所識別的短肽序列 GTEPL, 在蛋白 N 端依次連接短肽、剪切酶、6His 融合表達,親和上柱后剪切酶發(fā)揮作用使 N 端帶有 Gly 的目的蛋白從融合狀態(tài)中釋放出來9 。噬菌體展示庫是表達抗體或其它蛋白庫的重要克隆技術(shù), 與之相似將目的基因同適 合的錨定序列融合可以使產(chǎn)物蛋白表達到大腸桿菌的表 面。大腸桿菌展示所用的融合配體一般為細菌的膜蛋白或跨膜轉(zhuǎn)運體,如 PadL 是大腸桿菌長鏈脂肪酸的一種外 膜轉(zhuǎn)運體蛋白,N 端融合 PadL 表達胞內(nèi)酶,以全

7、細胞的形式催化反應表現(xiàn)出非常高的穩(wěn)定性10 ；Yang 等利用惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida 外膜酯酶 EstA 的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域作為表達胞內(nèi)-內(nèi)酰胺酶的錨定基序, 結(jié)果表明蛋白展示在細胞膜外并沒有影響細胞的活力11 。 1. 3共表達載體 很多真核基因表達的產(chǎn)物都必須以多聚復合體的形式組合才能表現(xiàn)出相應的活性, 因此在表達這一類目的基因的時候常構(gòu)建共表達載體,另外共表達的策略在輔助新生蛋白質(zhì)的折疊和分泌中也很有意義。Dzinenu 等針對表達異源 二聚體構(gòu)建 了可以同 pET 載體 共表達的 載體 pOKD ,這種載體含有 p15A 復制起點, 所以可以和大多數(shù)大腸桿菌表達載

8、體共存于細胞中12 。 細菌釋放素蛋白 (BRP)屬于細菌中的一類分泌蛋白, 共表達目的蛋白與 BRP 可以促進產(chǎn)物直接釋放到培養(yǎng)基中13 。另外,共表達 分子伴侶也是促進蛋白正確折疊的手段。目前對于分子伴侶構(gòu)成的網(wǎng)絡模式還處于探索階段, 研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中常見的分子伴侶 GroEL、H sp 同系物 DnaK 并非細胞內(nèi)所有蛋白折疊所必需的, 只有同核糖體結(jié)合的觸發(fā)因子協(xié)調(diào)作用才能促進蛋白的適當折疊13 。但是, 合理選擇個別的分子伴侶共表達可以避免產(chǎn)物在細胞內(nèi)錯誤的折疊以及沉積。M arco 等設計了共表達分子伴侶的 3 載體系統(tǒng), 其中兩種載體分別攜帶不同的分子伴侶, 另外一種載體攜 帶

9、目的基因, 分子伴侶與目的基因被分別獨立誘導14 。 Cpn60 和 Cpn10 是從嗜冷菌中分離的一類分子伴侶, 共表達后可以使大腸桿菌在 4低溫下生長, 有利于蛋白的正確折疊15 。與分子伴侶類似, 共表達 DsbA 或 Dsbc 等二硫鍵相關(guān)蛋白可以輔助形成正確的二硫鍵。 1. 4雙雜交系統(tǒng) 融合表達和共表達的另一個應用是利用雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)的相互作用。大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)也是有 3 種 載體構(gòu)成,誘餌蛋白融合表達載體、捕獲蛋白融合表達載 體和報告基因表達載體16 。以 AraC /LexA 雙雜交系統(tǒng)為 例,誘餌載體的啟動子選用 IPTG 誘導的 pT rc, 誘餌蛋白融合在轉(zhuǎn)錄激活

10、因子 ArcC 的 N 端表達, 帶有卡那霉素的抗性基因; 捕獲載體的啟動子選擇非IPTG 誘導的 pTet,可以在去水四環(huán)素的誘導下轉(zhuǎn)錄, 捕獲蛋白融合在 LuxA 操縱子效應物 LuxA 的 N 端, 帶有氨芐青霉素的抗性基因; 報告基因 LacZ 的啟動子選用大腸桿菌的 araBAD 啟動子, 其活性依賴于上游的 AraC 操縱子, 同時在啟動子下游安置 3 個定向重復的 LexA 操縱子半位點, 載體帶有大觀霉素的抗性基因,另外在 AraC 上游插入 4 個串聯(lián)的 rrnB 終 止子,減小轉(zhuǎn)錄通讀對報告基因活性的背景影響。此 3 載 體共表達系統(tǒng)的特點是誘餌蛋白同捕獲蛋白分別獨立誘導,

11、可以通過控制誘導物的濃度逐步放大雜交蛋白相互作用對報告基因表達的抑制效應。誘餌蛋白與捕獲蛋白分別結(jié)合在上游和下游的 2 個操縱子上, 如果二者可以發(fā)生雜交作用, 則在報告基因的 DNA 鏈上形成突環(huán), 使 AraC 轉(zhuǎn)錄激活效應發(fā)生逆轉(zhuǎn), 所以通過菌落的藍白斑差異可以篩選出發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)。 1. 5Univector 系統(tǒng) 通常在構(gòu)建重組子表達時需要依賴限制性內(nèi)切酶和連接酶的作有, 進行亞克隆, 而利用同源重組開發(fā)的載體可以實現(xiàn)基因的一次性克隆。Univector 表達系統(tǒng)(UPS) 就是這方面較為成功的實例16 。Univector 系統(tǒng)由兩類載體組成(圖 1): 一種稱為萬能的進入載

12、體 pUN1, 具有特殊的 loxP 重組序列,通過重組酶 Cre 可以方便地穿梭進入表達載體; 另一種即表達載體 pHOST , 同樣具有 loxP 序列, pHOST 是由不同的啟動子與融合標簽組成的載體系列, 便于高通量篩選蛋白產(chǎn)物。 Univector 系統(tǒng)的特點是平行獨立克隆到多載體中, 使之在不同的誘導條件下表達, 大大提高了表達的成功率, 尤其在蛋白組的研究中具有很大的應用潛力3 。2宿主細胞在大腸桿菌細胞內(nèi)表達目的基因的主要優(yōu)勢: 一個是宿主的遺傳背景比較清楚, 易于控制基因的表達; 另一個是大腸桿菌容易培養(yǎng), 可以獲得較高產(chǎn)量的目的蛋白。但是在商業(yè)應用中很多的蛋白產(chǎn)物是真核基

13、因編碼, 并且具有高級的三、四級結(jié)構(gòu), 要求翻譯后加工為正確的折疊形式或者糖基化蛋白等。由于大腸桿菌細胞的分子環(huán)境和折疊機制等與真核細胞具有很大的差異, 所以在應用大腸桿菌系統(tǒng)表達真核基因時有必要利用代謝工程或進化的 方法改造細胞, 解決大腸桿菌表達系統(tǒng)的局限性, 提高產(chǎn)物的活性。 2. 1代謝工程載體攜帶目的基因進入宿主表達會給宿主本身造成代謝上的負擔, 影響細胞的生長速率等, 推測可能是因為宿主不能提供足夠外源基因表達所需的原料及能量。減輕表達對于宿主的壓力可以通過控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)或者改變載體的抗性基因,還可以將目的基因直接插入染色體中表達。Flores 等則是將磷酸戊糖途徑的代謝關(guān)鍵酶6

14、磷酸葡萄糖脫氫酶的基因克隆到多拷貝質(zhì)粒中, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌使細胞的生長速率在誘導后得到恢復17 。 除了利用大腸桿菌的代謝機制改進表達系統(tǒng) ,另外還可以人為地在大腸桿菌中設計代謝途徑, 例如 Masip 等設計的二硫鍵合成途徑。在大腸桿菌中催化二硫鍵形成的是周質(zhì)蛋白 DsbA ,此蛋白通過膜蛋白 DsbB 得到循環(huán)利用。 Masip 等選擇硫氧化還原蛋白 TrxA 作為二硫鍵的供體, 使之在氧化態(tài)的胞質(zhì)內(nèi)形成二硫鍵, 通過融合 Tat 特異性前導肽從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì),使重組蛋白在周質(zhì)獲得二硫鍵。因此這一途徑不依賴 DsbADsbS 體系,僅通過胞內(nèi)的硫氧化還原蛋白就能形成二硫鍵,所以可以修復缺失

15、 DsbADsbB 體系 的宿主18 。2. 2定向進化 通常重組蛋白對于細胞內(nèi)的蛋白酶都很敏感,為了避免蛋白酶的作用除了分泌表達外還可以對相關(guān)的蛋白酶進行突變,例如篩選缺乏 ATP 依賴的胞內(nèi)蛋白酶的菌株, 但是對于是否細胞因此而上調(diào)其它的蛋白酶濃度還不清楚。另外在周質(zhì)中的蛋白酶也會降解產(chǎn)物蛋白, DegP 蛋白是存在于細胞周質(zhì)中的主要蛋白酶, 所以可以應用 degP 失活的宿主表達蛋白。同時,C 端為非極性的蛋白應該在 prc 突變的宿主中表達(Prc 蛋白酶作用于 C 端非極性的蛋 白), 或者以 N 端融合形式表達19 。前文已經(jīng)提到過選擇 分子伴侶的問題,利用定向進化的方法分離分子伴

16、侶或折疊因子的變異體,可以針對重組蛋白進行高效的特異性折 疊。Weissman 等對大腸桿菌進行多輪的 DNA 改組和篩選,分離出的 GroEL 突變體提高了對綠色熒光蛋白的折疊效率20 。另外,定向進化的方法還可以擴大大腸桿菌的遺傳密碼,在蛋白中添加非天然的氨基酸。決定氨酰 tRNA 合酶催化 tRNA 攜帶正確氨基酸的因素是不同于氨?；稽c的一個編輯位點。通過對染色體的隨機誘變,篩選出一類突變體可以催化 tRNAVal 結(jié)合Ser,并且20%細胞內(nèi)的 Val都被類似于 Ser 的氨基丁酸取代21 。 Schultz 等向大腸桿菌中引入一對特殊的 tRNA /氨酰 tRNA 合酶, 摻入對琥

17、珀密碼子應答的甲基化酪氨酸, 在表達二氫葉酸還原酶的實驗中發(fā)現(xiàn),由于非天然氨基酸的存在使基因翻譯的保真度達到99%22 。 2. 3蛋白質(zhì)的糖基化很長時間以來 , 大腸桿菌被認為不能表達糖基化蛋白,因為原核細胞普遍缺乏糖基化功能。而在真核細胞中,大多數(shù)分泌蛋白都在翻譯后加工過程中獲得 N 端的寡糖鏈。寡糖(Glc3Man9GlcAc2)被類脂運載體轉(zhuǎn)運到蛋白的 N 端, 由寡糖轉(zhuǎn)運酶催化寡糖與天冬酰氨或絲氨酸/蘇氨酸殘基形成 N 連接或 O 連接?？漳c彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一具有類似真核糖基化代謝功能的原核生物, 其基因組中的 pgl 基因簇編碼的蛋

18、白類似于真核細胞中的糖基轉(zhuǎn)移酶。Wacker 等將空腸彎曲桿菌的糖基化基因克隆到大腸桿菌中表達,結(jié)果 pgl 編碼的蛋白 PglB 可以指導質(zhì)粒編碼的 AcrA 蛋白的糖基化。 通過對表達產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn), 大腸桿菌與真核細胞表達的 糖蛋白在寡糖鏈組成上沒有相似性, 但是同樣與 AsnXaaSer /Thr 的氨基酸殘基結(jié)合23 。Schultz 等將進化突變的方法應用于蛋白的翻譯后加工中, 結(jié)果獲得了高產(chǎn)率的糖基化的肌紅蛋白。他們從甲烷球菌中分離出酪氨酸 tRNA 合酶 TyrRSs基因,在活性位點進行隨機突變, 經(jīng)過幾輪陽性和陰性篩選后得到對-乙酰氨基葡萄糖-絲氨酸具有特異性的 TyrRSs

19、。這種氨酰 tRNA 合酶可以對琥珀密碼子 TAG 應答催化形成 tRNATyrGlcNAc 對; GlcNAc 的摻入為蛋白的糖基化提供了初級的糖基化位點, 可以被糖基轉(zhuǎn)運酶識別進一步合成復雜的糖鏈。這種方法也可以應用于其它的翻譯后加工中 ,包括蛋白的甲基化、磷酸化、乙?；?4 。 基因的表達過程是一個復雜的過程, 涉及基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后加工、細胞的代謝以及細胞內(nèi)基因與蛋白、蛋白與蛋白之間的相互作用。 進入后基因時代之后, 大腸桿菌首先被選作研究蛋白組學、基因功能、蛋白質(zhì)網(wǎng)絡等新課題的模型, 揭示了很多基因表達的未知領(lǐng)域, 同 時提供了更多發(fā)展大腸桿菌表達系統(tǒng)的依據(jù)。伴隨分子生物學新

20、技術(shù)的涌現(xiàn),大腸桿菌勢必在實驗研究及工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白的應用中發(fā)揮出更大的作用。參考文獻1 Reed J L, Palsson B. T hirteen Years of Building ConstraintBased In Silico Models of Escherichia coli J . Journal of Bacteriology , 2003,185(9):2692.2 Lee P S, Lee K H. Escherichia ColiA Model System That Benefits From and Contributes to the Evolution of

21、Proteomics J . Biotechnol Bioeng , 2003,84(7):801. 3 Berthold D A, Stenmark P, Nordlund P. Screening for functional expression and overexpression of a family of diironcontaining interfacial membrane proteins using the univector recombination sy stem J . Protein Science, 2003,12:124. 4 Qing G, Ma L,

22、Khorchid A, et al. Coldshock induced highyield protein production in Escherichia coli J. NatureBiotechnology, 2004,22: 877. 5 Choi J H, Lee SY. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli J. Appl Microbiol Biotechnol, 2004,64(5):625. 6 Egorov M V, Tigerstrom

23、 A, Pestov N B, et al. Purification of a recombinant membrane protein tagged with a calmodulinbinding domain : properties of chimeras of the Escherichiacoli nicotinamide nucleotide transhydrogenase and the Cterminus of human plasma membrane Ca2+A TPase J . Protein Expr Puri f , 2004,36(1):31. 7 Laml

24、a T, Erdmann V A. The Nanotag, a streptavidinbinding peptide for the purification and detection of recombinant proteins J. Protein Expr Puri f , 2004,33(1):39. 8 T rabbicCarlson K, Liu L, Kim B, et al. Expression and purification of recombinant proteins from Escherichia coli: Comparison of an elasti

25、nlike polypeptide fusion with an ol i gohistidine fusion J . Protein Sci, 2004,13(12):3274. 9 M ao H. A selfcleavable sortase fusion for onestep purification of free recombinant proteins J . Protein Expr Puri f , 2004,37(1):253. 10 Lee S H , Choi J , Park S J, et al. Display of Bacterial Lipase on t

26、he Escherichiacoli Cell Surface by Using FadL as an Anchoring M otif and U se of the Enzyme in Enantioselective Biocatalysis J . Applied and Environmental Microbiology , 2004,70(9):5074. 11 Yang T H, Pan J G, Seo Y S , et al. Use of Pseudomonas putida EstA as an Anchoring M otif for Display of a Per

27、iplasmic Enzyme on the Surface of Escherichia coli J . Appl Environ Microbiol, 2004,70(12):6968. 12 Dzivenu O K, Park H H , Wu H. General coexpression vectors for the overex pression of heterodimeric protein complexes in Escherichia coli J . Protein Expr Puri f , 2004, 38(1): 1. 13 Deuerling E, Schu

28、lzeSpeching A, Tomoyasu T, et al. Trigger factor and DnaK cooperate in folding of newly synthesized proteins J . Nature, 1999,400: 693. 14 Marco A, Marco V D. Bacteria cotransfo rmed with recombinant proteins and chaperones cloned in independent plasmids are suitable for expression tuning J . J Biot

29、echnol, 2004,109(12):45. 15 Ferrer M , Chernikova T N, Timmis, et al. Expression of a temperaturesensitive esterase in a novel chaperonebased Escherichia coli strain J . Appl Environ Microbiol, 2004, 70(8): 4499. 16 Hu J C, Kornacker M G, Hochschild A. Escherichia coli One-and Twohybrid systems for the analy sis and identification of proteinprotein interaction J . Methods, 2000, 20: 80. 17 Flores S, de Anda-Herrera R, Gosset G, et al. Growthrate recovery of Escherichia coli cultures carrying a multicopy plasmid, by engineering of the pentosephosphate p