趨淋巴抗癌藥絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物的合成及生物學(xué)性質(zhì)的研究

1、    趨淋巴抗癌藥絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物的 合成及生物學(xué)性質(zhì)的研究        摘要利用右旋糖酐(T10500)局部注射后可選擇性被網(wǎng)狀上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞通過(guò)胞飲作用攝取，而不會(huì)透過(guò)毛細(xì)血管壁進(jìn)入血液，在體內(nèi)很快被代謝，無(wú)毒無(wú)滯留的特性，將一定分子量的右旋糖酐(T77)與抗腫瘤小分子藥物絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)通過(guò)一個(gè)間隔基偶聯(lián)成高分子靶向抗腫瘤藥物：絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物(MMC-D)，對(duì)偶聯(lián)物的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并將該偶聯(lián)物用于口腔

2、癌淋巴轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)性研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明MMC-D具有強(qiáng)的抗腫瘤活性，并具有明顯的趨淋巴靶向性.關(guān)鍵詞高分子靶向抗腫瘤藥物；絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物；趨淋巴靶向性Synthesis of the Anticancer Drug with Affinity to LymphMMC-Dextran Conjugate and Studies on Its Biological PropertiesYan Zhongqin,Zhong Yuguo(School of Pharmacy,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)We

3、n Yuming,Qiu Chengping(College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)AbstractSince DextranT10500 can be uptaken by megalophage and reticulum epithelial cells,and it can not penetrate the walls of the blood capillaries into the blood,the authors designed a kind of ma

4、cromolecular anticancer drug with affinity to lymph,Drug-Dextran conjugate.This kind of conjugate is conjuation of Dextran and micromolecular anticancer agent mitomycin C(MMC)by a space.We used this conjugate in the experimental therapy of lymphatic transfer of animal oral cavity cancer.All the resu

5、lts of the tests indicated that MMC-D had strong affinity to lymph,all the same MMC-D and MMC had almost the same sensitivity to the test cells.Key wordsmacromolecular anticancer drug;MMC-Dextran conjugate;affinity to lymph轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性之一，淋巴轉(zhuǎn)移在腫瘤的轉(zhuǎn)移中很常見，而且嚴(yán)重影響治療效果1.近年來(lái)對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移的化療藥物研究最多的是高分子靶向抗腫瘤藥物.其

6、重點(diǎn)在于尋找選擇性更強(qiáng)，治療效果更好的載藥體系.在該類藥物的研究中，以多糖如葡聚糖，甲殼胺作載體的很多2.這類偶聯(lián)物是通過(guò)淋巴細(xì)胞特異性攝取具有一定分子大小的偶聯(lián)物的特性，將偶聯(lián)物濃集于靶組織區(qū)域3.由于該種偶聯(lián)物具有較大的分子體積，不能透過(guò)毛細(xì)血管壁進(jìn)入血液，只能被網(wǎng)狀上皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞通過(guò)胞飲作用，將偶聯(lián)物整體攝入細(xì)胞內(nèi)，然后在酶的作用下，水解出活性物質(zhì)，起到殺死腫瘤細(xì)胞的作用.因而這類高分子載體靶向藥物最適于淋巴結(jié)處腫瘤或淋巴轉(zhuǎn)移腫瘤的治療，且載體本身無(wú)抗原性.絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)是一種抗腫瘤抗生素，對(duì)各種革蘭氏陽(yáng)性菌有強(qiáng)的抗菌作用.臨床常用的抗腫瘤藥物，其分子量

7、小，毒副作用大，不能選擇性地對(duì)淋巴轉(zhuǎn)移癌起作用.而右旋糖酐(T10500)能選擇性地被淋巴系統(tǒng)攝取3，作者將小分子抗腫瘤藥物MMC與右旋糖酐偶聯(lián)成高分子靶向抗腫瘤藥物，用于口腔癌淋巴轉(zhuǎn)移的導(dǎo)向治療.1合成路線設(shè)計(jì)右旋糖酐的活化、間隔基的偶聯(lián)及MMC-D的合成，如1所示.Fig.1The route of synthesis2實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果儀器：島津UV-2201紫外檢測(cè)儀，LKB-2023型、85-2型磁力恒溫?cái)嚢杵?上海司樂(lè)儀器廠)，LG-3型多用冰凍干燥機(jī)，PHB-4型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)，2F-型三用紫外分析儀(上海碩村電光儀器廠)，P-E 983G紅外測(cè)定儀，Carlo Erba

8、1106型元素分析儀，MR700型酶標(biāo)儀，Coulter Epics ELite ESP流式細(xì)胞儀.藥品：右旋糖酐(Dextran,T77,Sigma Chemical Co.)，溴化氰(Merck公司產(chǎn)品)，6-氨基己酸(上海試劑三廠)，EDC1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司)，絲裂霉素(MMC，浙江海門制藥廠)，四氮唑(MTT，分析純)，DMSO(分析純)，PI染液.細(xì)胞：0-1V(宮頸癌細(xì)胞)，Tca8113(人舌癌細(xì)胞)，人白血癌細(xì)胞K562，高淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞株小鼠宮頸癌U14(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所建株，購(gòu)于四川抗生素研究所藥理室).R

9、PMI 1640，10%小牛血清和抗生素為培養(yǎng)基.成年金黃地鼠(NIH)雌雄各半(購(gòu)于四川抗生素研究所).2.1絲裂霉素-右旋糖酐偶聯(lián)物(MMC-D)T77的合成及鑒定將0.50 g右旋糖酐溶于50 mL注射用水中，在16條件下攪拌溶解成無(wú)色澄清的溶液，分次加入0.28 g溴化氰無(wú)色粉末，用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH 11.0，反應(yīng)16 min后，加入0.50 g 6-氨基己酸，攪拌溶解，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH 9.0，于16條件下反應(yīng)24 h，然后在4 條件下用pH 9.0的碳酸鈉溶液透析3 d，至透析外液用硝酸酸化后與硝酸銀反應(yīng)無(wú)沉淀生成，取少許透析內(nèi)液減壓室溫干燥.IR(KBr)c

10、m-1：3415，2932，1637，1560，1407，1014.取出透析內(nèi)液，加入50 mg絲裂霉素，攪拌溶解成藍(lán)色溶液，再加入1.00 g EDC，攪拌溶解后，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH 55.5，于16 條件下反應(yīng)24 h，反應(yīng)完成之后，在4 條件下用水透析3 d，至透析外液無(wú)小分子藥物MMC透出，取出內(nèi)液，呈紫藍(lán)色溶液，紫外分光光法分析溶質(zhì)含量=22 000(98.9%).冰凍干燥后，用Sephadex G-50柱進(jìn)行色譜分析，微孔濾膜(0.65m)過(guò)濾，分裝于10 mL安瓿中，相當(dāng)于1.0 mg/瓶，冰凍干燥，熔封，得MMC-D凍干制劑，4 避光保存.元素分析實(shí)測(cè)值(%)：C 40

11、.97，N 6.21，H 5.78.2.2偶聯(lián)物中小分子藥物的含量測(cè)定取冷凍干燥后的偶聯(lián)物MMC-D 11.7 mg(真空干燥24 h)，定容到50.0 mL水溶液，紫外364 nm處測(cè)定其含量為6.67%(w/w,相當(dāng)于MMC的含量).2.3體外藥敏實(shí)驗(yàn)2.3.1MTT法測(cè)定MMC-D對(duì)癌細(xì)胞的敏感性4將培養(yǎng)48 h的細(xì)胞分別接種至96孔板內(nèi)，每孔接種10 000個(gè)細(xì)胞(100 L接種后擴(kuò)增，待孔板內(nèi)長(zhǎng)滿細(xì)胞為止)，共六板.于每板上的每種細(xì)胞中加入不同濃度的二種藥物各100 L/孔，藥物濃度為：0.025，0.125，0.25，1.25，2.5，25，50 g/mL.然后于37 ，5%二氧化

12、碳的孵箱中培養(yǎng)，加入藥物后第1，2，3，4，5，6 d終止藥物反應(yīng)，加入MTT(20 L/孔)，2 h后去掉反應(yīng)混合液，再加入DMSO，振搖10 min，顯紫色，于酶標(biāo)儀上測(cè)定光密度(OD).即可測(cè)出相當(dāng)于活細(xì)胞的數(shù)目值.經(jīng)計(jì)算機(jī)EXCEL程序數(shù)據(jù)處理，比較50 g/mL的MMC，MMC-D二種藥物分別對(duì)0-1 V，Tca8113兩種細(xì)胞的作用強(qiáng)弱，結(jié)果見表1.Tab.1OD values tested by MTT assaySampleO-1VTca8113Time/dTime/d123456123456MMC(50 g/mL)0.45100.61400.40750.37700.30300

13、.17200.63900.81400.53200.46000.45800.2235MMC-D(50 g/mL)0.51400.62600.47200.59950.47850.26750.67800.82500.81900.88800.52600.4260MTT法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：MMC，MMC-D二種藥物對(duì)鱗癌細(xì)胞均有一定的殺傷作用，其中MMC-D的藥效稍低于MMC，且起效較MMC慢，可能是由于MMC-D在體內(nèi)有一水解過(guò)程，但持效長(zhǎng).2.3.2應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)定法測(cè)定MMC，MMC-D對(duì)白血癌細(xì)胞K562的敏感性5取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的白血癌細(xì)胞K562置于24孔板(200 000個(gè)/孔)，每孔體積1.

14、0 mL，共8孔.每孔分別編號(hào)，并于每孔分別加入濃度為0.5 mg/mL的藥液10，30，50 L，共2種藥物(MMC-D，MMC)于37，5%二氧化碳的孵箱中孵育48 h.在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，有成團(tuán)或浮起的細(xì)胞，有的細(xì)胞核固縮，碎裂.將細(xì)胞培養(yǎng)板取出，用滴管吹打數(shù)次，使細(xì)胞最大程度游離，將每孔的細(xì)胞懸液盡可能全部地轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀專用試管中，一一對(duì)應(yīng)并編號(hào)，以1 800 r/min離心5 min，傾去上清液，試管底部留下細(xì)胞，于每管中加入0.8 mL的PI染液，染色30 min，待測(cè)定.用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)周期變化分析，結(jié)果見表2和表3. Tab.2The percenta

15、ge(%) of apoptosis cells in total K562 cellstreated by different concentrations of MMC and MMC-D at different timeControlMMCMMC-DConcentration/g.mL-1Concentration/g.mL-151525515254.430.639.445.527.235.744.0Tab.3The effects of different concentrations ofMMC and MMC-D on the growth period of K562 at d

16、ifferent timeSampleConc./g.mL-1The percentage of every growth period/%G1G2Scontrol50.914.634.4550.04.445.6MMC1561.33.235.42569.91.029.1538.33.558.3MMC-D1552.15.941.92559.32.238.5表2和表3顯示MMC和MMC-D均對(duì)癌細(xì)胞K562有較強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)作用，對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期影響也相當(dāng)大，且都有濃度依賴性.MMC-D的生物活性比MMC略低，但仍保持強(qiáng)的活性.這一結(jié)果與MTT法對(duì)MMC-D的藥敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.2.4趨淋巴性研究

17、2.4.1微生物測(cè)定法確定MMC-D的效價(jià)6用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis 63501)作試驗(yàn)菌，制備合格的枯草芽孢桿菌懸液，取0.3%懸液5 mL加入含有培養(yǎng)基20 mL的雙碟中，以等距離安置不銹鋼管4枚，分別滴加不同濃度的MMC和MMC-D，加入藥物后于37培養(yǎng)1618 h，量取抑菌圈直徑大小，效價(jià)按抗生素檢測(cè)法二劑量公式計(jì)算，得出1 g MMC-D相當(dāng)于0.115 g的MMC.2.4.2小鼠體內(nèi)藥物分布試驗(yàn)在已建立的成年金黃地鼠(NIH)頸淋巴轉(zhuǎn)移小鼠宮頸癌U14細(xì)胞的模型中，選擇30例，分3個(gè)時(shí)間段即分成三組，每組10只，每?jī)芍恍∈蟮难土馨头謩e結(jié)合成一個(gè)樣本，在

18、雙頰部腫瘤瘤周給藥MMC-D 0.2 mg(相當(dāng)于MMC的含量)，注射后12，24，48 h斷頸處死，摘眼球取血，留取淋巴結(jié)，稱重.另取淋巴結(jié)送光鏡檢測(cè).對(duì)照組12只NIH小鼠尾靜脈注射0.1 mg MMC，注藥后12，24，48 h斷頸處死，同法留取樣本.取6只NIH正常小鼠，不給藥，作陰性對(duì)照.在裝有培養(yǎng)基的平皿內(nèi)接種枯草桿菌63501，待菌體鋪滿培養(yǎng)基表面后放入鋼杯，在杯內(nèi)分別加入淋巴結(jié)組織生理鹽水勻漿(1 mL/g)上清液和小鼠血漿離心上清液，37 孵育1618 h后，測(cè)定培養(yǎng)基表面枯草桿菌抑菌環(huán)直徑大小，根據(jù)其生物活性效價(jià)換算成淋巴結(jié)和血漿中藥物濃度，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理.淋巴結(jié)中藥物濃

19、度見表4，在血漿中各時(shí)間段的樣本以及對(duì)照組淋巴結(jié)樣本中均未檢測(cè)出藥物. Tab.4The concentrations of MMC-D in the lymph node of mice with U14g/gGroupTime/hGroupTime/h122448122448137.5228.7321.32435.3527.3222.47233.4329.5220.54530.4728.4519.39330.2929.2119.05P0.01 該生物檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限度為3.8 g/g組織，因此可以得出淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度比血液中的藥物濃度至少高6倍以上.即MMC-D較MMC具有高的親淋巴性

20、.3討論3.1MMC-D的合成，是采用溴化氰活化法7，8.溴化氰是一種強(qiáng)的氰化劑，活性很高，因此活化溫度不宜過(guò)高，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)溫度偏高(高于23)，活化過(guò)快，活性物質(zhì)極易失活，溫度偏低(低于4)，生成的活性物質(zhì)在水中的溶解性降低.經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溫度為16最好.活化時(shí)間也不易過(guò)長(zhǎng)，活化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(超過(guò)30 min)，活性物質(zhì)失活，偶聯(lián)率降低，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)在816 min較好.3.2測(cè)定腫瘤化療藥物敏感性的方法有多種.最近發(fā)現(xiàn)許多化療藥物均能誘導(dǎo)敏感細(xì)胞發(fā)生凋亡10.目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)凋亡最準(zhǔn)確的方法是流式細(xì)胞儀和DNA瓊脂糖電泳.作者運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定法對(duì)偶聯(lián)物MMC-D的凍干制劑對(duì)細(xì)胞K562的敏

21、感性進(jìn)行測(cè)定.流式細(xì)胞儀測(cè)定法能更客觀地反映腫瘤細(xì)胞藥物作用后的功能和形態(tài)學(xué)變化特征，同時(shí)還能觀察藥物不同濃度在不同時(shí)間引起腫瘤細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化特征以及分析藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期的影響，較MTT法能更客觀、更準(zhǔn)確地反映藥物對(duì)細(xì)胞的敏感性.3.3MMC為抗菌素類非特異性抗腫瘤藥物，既具有抗癌作用，還具有抗菌作用.因此可以通過(guò)藥物對(duì)細(xì)菌抑菌環(huán)的大小來(lái)間接測(cè)定血漿和淋巴組織中的藥物濃度.試驗(yàn)結(jié)果顯示，局部給MMC-D后，小鼠頸淋巴結(jié)內(nèi)藥物濃度較血漿中至少高6倍以上，該結(jié)果支持了作者對(duì)趨頭頸部淋巴抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)思想.同時(shí)由于MMC-D的體內(nèi)半衰期大于24 h，因此設(shè)計(jì)的取標(biāo)本的時(shí)間段較長(zhǎng).而MMC的半衰期為8 min，在預(yù)試中發(fā)現(xiàn)MMC靜注動(dòng)物體內(nèi)后30 min以內(nèi)，頸淋巴結(jié)中仍然沒有檢測(cè)出藥物.因此所選時(shí)間段對(duì)MMC基本不受其半衰期的影響.作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)忠勤通訊聯(lián)系人作者單位：嚴(yán)忠勤鐘裕國(guó)華西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，成都 610041溫玉明邱成平華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院頜面外科，成都 610041參考文獻(xiàn)1鄭家偉，陳寶勇.國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤分冊(cè).1995，22(6)：3433452Hasnida M,Takakura Y,Matsumo S,et al.Regeneration characteristics in relation to its activit