苯安莎類抗生素的一種早期鑒別方法

1、苯安莎類抗生素的一種早期鑒別方法                 作者：劉愛(ài)明 武臨專 王以光 張會(huì)圖 赫衛(wèi)清 李永海 張侃【摘要】  目的 建立一種對(duì)苯安莎類抗生素特異的顏色反應(yīng)早期鑒別方法。方法 根據(jù)堿性處理苯安莎類抗生素，使其安莎鏈與苯環(huán)連接的酰胺鍵開(kāi)裂后化合物呈紫色的原理，建立了將發(fā)酵液粗提品進(jìn)行薄層色譜層析后采用2.0mol/L NaOH溶液噴涂顯色的早期鑒別方法；以格爾德霉素為例，在硅膠板上的檢測(cè)靈敏度為

2、4g。結(jié)論 采用該顏色鑒別反應(yīng)方法：對(duì)兩株確證為新的格爾德霉素產(chǎn)生菌Streptomyces sp. 4?4以及Streptomyces sp. 3?57進(jìn)行了佐證；對(duì)吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的一株格爾德霉素生物合成后修飾基因阻斷變株CT?1中產(chǎn)生的格爾德霉素前體物及其類似物，在硅膠板上進(jìn)行了快速定位和初步鑒別。 【關(guān)鍵詞】  苯安莎類抗生素； 酰胺鍵； 顏色反應(yīng)； 鑒別    ABSTRACT  Objective  Establishing a simple and sensiti

3、ve method for early preliminary discrimination of benzenic ansamycins and their derivatives.  Method  Most natural benzenic ansamycins are yellow compounds, some are white or colorless compounds. After treatment of alkali such as NaOH or sodium methoxide, which breaks the amide bond formed

4、 between the benzenic amino?group and the ansa?bridges terminal carboxy?group, benzenic ansamycins such as geldanamycin changed its color from yellow to purple. The minimal detection limit of this method on the silica gel plate for geldanamycin was 4g with NaOH (2.0mol/L) sprayed. Results  This

5、 color change reaction method was used successfully for early preliminary discrimination of geldanamycin produced by two soil?isolated novel strains, Streptomyces sp. 4?4 and Streptomyces sp. 3?57, with ansamycin producing potential(s), and fast location and preliminary discrimination on silica gel

6、plate of geldanamycin derivatives produced by CT?1, a mutant strain of Streptomyces hygroscopicus 17997 with one of the geldanamycin biosynthetic tailoring genes being disrupted. 安莎類抗生素具有重要的生物學(xué)活性，例如，利福霉素是目前臨床上最重要的抗結(jié)核病藥物之一；格爾德霉素(geldanamycin)具有抗腫瘤和抗病毒活性等。安莎類抗生素還具有抗細(xì)菌(革蘭陽(yáng)性菌)、抗霉、抗酵母和抗原蟲(chóng)等活性。因此，安莎類抗生素日益受

7、到人們的重視。    安莎類抗生素為一個(gè)脂肪鏈(稱為安莎橋)連接于芳香環(huán)的兩個(gè)不相鄰原子間的一類化合物，其中的芳香環(huán)有苯環(huán)和萘環(huán)兩種，所以安莎類抗生素可以分為苯安莎類抗生素(例如格爾德霉素)和萘安莎類抗生素(例如利福霉素)兩種。在已知的安莎類抗生素中，無(wú)論是苯安莎類抗生素還是萘安莎類抗生素，其安莎橋的一端均通過(guò)酰胺鍵與芳香環(huán)相連(迄今唯有萘安莎類抗生素紅迪菌素例外，其酰胺鍵上的羰基被進(jìn)一步還原)。    在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物篩選的過(guò)程中，陸續(xù)有安莎類抗生素被發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。例如，GlaxoWellcome公司的Stead等1在篩選抗制癌蛋

8、白M抑制劑的過(guò)程中從一株鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一組格爾德霉素類似物，日本的Hosokawa等2，3在篩選腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制劑中獲得了噻唑三烯霉素(thiazinotrieno?mycins)，Kakeya等4在篩選白血病細(xì)胞系IL?60的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑中得到了胞三烯菌素A(cytotrienin A)。除莠霉素和格爾德霉素都是較早發(fā)現(xiàn)的苯安莎類抗生素，具有除草、抗菌、抗腫瘤和抗病毒等活性；格爾德霉素由于其優(yōu)越的抗腫瘤活性，目前受到重視；在國(guó)內(nèi)，胡海峰5、朱寶泉6等在免疫抑制劑的篩選過(guò)程中獲得了除莠霉素A及其產(chǎn)生菌和格爾德霉素及其產(chǎn)生菌。但是至今還沒(méi)有見(jiàn)到有關(guān)安莎類抗生素早期鑒別方法的報(bào)

9、道。    本文作者所在實(shí)驗(yàn)室根據(jù)安莎類抗生素的生物合成原理，建立了一種專門針對(duì)安莎類抗生素產(chǎn)生菌的分子篩選模型。從土壤分離的約1900株未知放線菌中篩選得到了一批具有產(chǎn)生安莎類抗生素潛能的放線菌7，這些菌株的發(fā)酵產(chǎn)物絕大多數(shù)具有抗菌、抗病毒或抗腫瘤活性。如何從這些陽(yáng)性菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中快速、準(zhǔn)確地鑒別安莎類抗生素，顯得特別重要和迫切。    多數(shù)安莎類抗生素具有顏色(多為黃色)，安莎橋中含有三烯鍵的安莎類抗生素具有特征性的紫外吸收峰(268、278和290nm)；這些性質(zhì)對(duì)于鑒別安莎類抗生素有一定幫助，但不能夠作為比較可靠的、早期鑒別

10、安莎類抗生素的方法。安莎類抗生素的分子結(jié)構(gòu)中，安莎橋的一端通過(guò)酰胺鍵與芳香環(huán)相連。Schnur等8利用甲醇鈉(一種強(qiáng)堿)使格爾德霉素的酰胺鍵開(kāi)裂，產(chǎn)生了紫色化合物(圖1)。我們推測(cè)NaOH同樣具有開(kāi)裂格爾德霉素的芳香環(huán)與安莎橋之間形成的酰胺鍵作用。楊紅玲等9在除莠霉素A(herbimycin A)結(jié)構(gòu)類似物的分離鑒定中提及用堿處理除莠霉素A及其衍生物可以產(chǎn)生紫色化合物。    格爾德霉素和除莠霉素A均屬于苯安莎類抗生素。通過(guò)堿性處理使苯安莎類抗生素中芳香環(huán)與安莎橋之間形成的酰胺鍵開(kāi)裂、產(chǎn)生紫色化合物，有可能成為早期鑒別苯安莎類抗生素的一個(gè)特異性顏色反應(yīng)方法。本文表

11、明該顏色反應(yīng)可用于具有產(chǎn)生安莎類抗生    圖1    CH3ONa打開(kāi)格爾德霉素的芳香環(huán)與安莎橋之間形成的酰胺鍵素潛能的放線菌發(fā)酵液粗提物的分析，并在苯安莎類抗生素(格爾德霉素)的生物合成基因阻斷變株發(fā)酵產(chǎn)物的早期鑒別中，也發(fā)揮了顯著作用。    1  材料與方法    1.1  材料    (1)菌株  Streptomyces hygroscopicus 17997?CT?1，格爾德霉素生物合成后修飾基因阻斷變

12、株10(原株具有格爾德霉素產(chǎn)生能力)；鏈霉菌Streptomyces sp. 4?4以及Streptomyces sp. 3?57為從土壤中分離的2株發(fā)酵產(chǎn)物未知的鏈霉菌(AHBA合酶基因篩選陽(yáng)性菌株)7；這些菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。    (2)試劑  甲醇鈉(sodium methoxide，anhydrous powder)為ACROS ORGANICS公司試劑。NaOH為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。格爾德霉素對(duì)照品，本實(shí)驗(yàn)室自備。利福霉素SV標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。硅膠板為青島海洋化工廠分廠GF254產(chǎn)品和德國(guó)Merck公司Silica Ge

13、l 60 F254產(chǎn)品。    1.2  方法    取一定量格爾德霉素對(duì)照品或待測(cè)菌株發(fā)酵上清液的乙酸乙酯提取物，溶于無(wú)水甲醇中，點(diǎn)樣于硅膠板上，在乙酸乙酯二氯甲烷正己烷甲醇(9661)溶媒系統(tǒng)中展層。展層結(jié)束后，用少量NaOH(2.0mol/L)溶液進(jìn)行噴涂，觀察TLC平板上的顏色變化，照相記錄。    取一定量格爾德霉素對(duì)照品或待測(cè)菌株發(fā)酵上清液的乙酸乙酯提取物，溶于無(wú)水甲醇中，于玻璃試管或eppendorf管中直接加入約等質(zhì)量的NaOH(濃度為2.0mol/L)或甲醇鈉(固體粉末，或者其

14、甲醇溶液)，觀察顏色變化，采用上述溶媒系統(tǒng)進(jìn)行硅膠板展層分析。    2  結(jié)果與討論    2.1  格爾德霉素的顯色反應(yīng)    格爾德霉素對(duì)照品不同量(4、8、16、32g)在硅膠板上用NaOH(2.0mol/L)噴涂后的顯色?？梢钥闯?，格爾德霉素用堿處理后的顯色反應(yīng)檢測(cè)靈敏度(4g)高于其本身具有的顏色。百事通    2.2  三株鏈霉菌發(fā)酵上清液乙酸乙酯提取物中苯安莎類抗生素的早期鑒別    兩株鏈霉菌菌株S

15、treptomyces sp. 4?4和Streptomyces sp. 3?57，是本文作者實(shí)驗(yàn)室采用AHBA合酶基因PCR篩選模型獲得的AHBA合酶基因陽(yáng)性菌株，推測(cè)具有產(chǎn)生安莎類抗生素的可能性；吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997 CT?1為格爾德霉素生物合成后修飾基因阻斷變株(簡(jiǎn)稱CT?1)，推測(cè)仍然具有合成格爾德霉素前體物的能力。這三株鏈霉菌的發(fā)酵上清液乙酸乙酯提取物在硅膠板上展層后用2.0mol/L NaOH噴涂前和噴涂后的顯色反應(yīng)(圖2)，可以初步確定Streptomyces sp. 4?4和Streptomyces sp. 3?57兩株菌發(fā)

16、酵液中產(chǎn)生的與格爾德霉素對(duì)照品在硅膠板上Rf值相同的物質(zhì)為格爾德霉素(化學(xué)分離與鑒定已證實(shí)它們?yōu)楦駹柕旅顾?，結(jié)果另文發(fā)表)。格爾德霉素生物合成后修飾基因阻斷變株CT?1發(fā)酵液中的化合物CT?1?7，顯示明顯的紫色反應(yīng)，提示其為格爾德霉素生物合成前體物(已經(jīng)證實(shí)其為7?餐尋奔柞；?4，5?菜?氫格爾德霉素10)。變株CT?1發(fā)酵液中的化合物CT?1?1，在用2.0mol/L NaOH噴涂后，顏色逐漸變?yōu)槠t紫色。將化合物CT?1?1純化后，硅膠板展層并進(jìn)行2.0mol/L NaOH噴涂顯色，結(jié)果也是逐漸變?yōu)槠t紫色，提示其為一個(gè)新的格爾德霉素類似物(已經(jīng)證實(shí)其為一個(gè)新結(jié)構(gòu)的格爾德霉素類似物，結(jié)果

17、另文發(fā)表)。    3  討論    對(duì)于NaOH作用于苯安莎類抗生素后的顯色反應(yīng)機(jī)制，本文作者曾以格爾德霉素為例進(jìn)行了初步探索。格爾德霉素分別與甲醇鈉(溶于甲醇)和NaOH(溶于水)于Eppendorf管中作用后，在乙酸乙酯二氯甲烷正己烷甲醇(9661)溶媒系統(tǒng)(需要滴加數(shù)滴冰乙酸，可將COONa轉(zhuǎn)換為COOH)中展層后的紫色化合物Rf值(約0.30)基本相同(顯著小于格爾德霉素本身的Rf值0.63)。在乙酸乙酯二氯甲烷正己烷甲醇(9661)溶媒系統(tǒng)中如果不滴加冰乙酸進(jìn)行展層，那么NaOH作用于格爾德霉素后的部分(甚至全部

18、)產(chǎn)物在硅膠板點(diǎn)樣原點(diǎn)上保持不動(dòng)的鑒別(NaOH噴涂后)(形成羧酸鈉鹽的緣故)。這些現(xiàn)象說(shuō)明NaOH也是將格爾德霉素芳香環(huán)上的氨基與安莎橋上的羧基所形成的酰胺鍵開(kāi)裂、產(chǎn)生紫色化合物(圖1)。甲醇鈉開(kāi)裂酰胺鍵的反應(yīng)機(jī)制是堿催化醇解，NaOH開(kāi)裂酰胺鍵的反應(yīng)機(jī)制是堿性條件下水解，二者作用于格爾德霉素后產(chǎn)生的紫色化合物是有細(xì)微結(jié)構(gòu)差異的，但尚不至于造成硅膠板上Rf值顯著差異。    NaOH用作硅膠板噴涂顯色的效果明顯好于甲醇鈉，加上NaOH便宜、易得，因而采用NaOH溶液噴涂硅膠板顯色更加經(jīng)濟(jì)、方便和有效。    格爾德霉素和除莠霉素A具

19、有本文介紹的顯色反應(yīng)，這兩個(gè)化合物均屬于苯(醌型)安莎類抗生素。雙氫除莠霉素A屬于苯(酚型)安莎類抗生素，楊紅玲等提及該化合物也具有遇堿顯示紫色的反應(yīng)9。本文作者推測(cè)，含有三烯鍵的苯(醌型)安莎類抗生素如安莎三烯(ansatrienin)11，也可能具有本文介紹的紫色反應(yīng)。某些苯安莎類抗生素如部分柄型菌素(ansamitocin)類化合物，其芳香環(huán)與安莎橋之間的酰胺鍵被進(jìn)一步修飾與取代，這類苯安莎類抗生素是否具有本文介紹的顯色反應(yīng)，尚不清楚。    不同的苯安莎類抗生素在酰胺鍵開(kāi)裂的難易程度以及開(kāi)裂后的化合物顏色方面可能會(huì)存在一定的差異。本文中的格爾德霉素類似物C

20、T?1?1和CT?1?7分別為格爾德霉素的芳香環(huán)和安莎橋上發(fā)生修飾或變化后的衍生物。CT?1?7用NaOH噴涂后即刻顯示紫色，CT?1?1用NaOH噴涂后約20min顯示偏紅紫色，提示苯安莎類抗生素芳香環(huán)上的取代基變化，不僅對(duì)酰胺鍵開(kāi)裂后的化合物顏色有一定影響，對(duì)NaOH開(kāi)裂酰胺鍵的速度也有影響；而苯安莎類抗生素安莎橋上的取代基變化對(duì)NaOH開(kāi)裂酰胺鍵的速度以及酰胺鍵斷裂后化合物的顏色影響較小。    由于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，本文介紹的顏色反應(yīng)可能僅適用于已知具有安莎類抗生素產(chǎn)生潛能的放線菌所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物中苯安莎類抗生素的早期、初步鑒

21、別和定位，如果用于從大量的放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中早期發(fā)現(xiàn)苯安莎類抗生素，有可能會(huì)產(chǎn)生許多假陽(yáng)性結(jié)果，因?yàn)橛鰤A變紫色的化合物并不一定都是苯安莎類抗生素；已知羥基醌類化合物在堿性溶液中也發(fā)生顏色改變，使顏色加深，多呈橙、紅、紫紅色及藍(lán)色，羥基蒽醌類化合物遇堿顯示紅紫紅色(Borntrgers反應(yīng))12。    本文作者曾經(jīng)用甲醇鈉和NaOH分別作用于萘安莎類抗生素利福霉素SV樣品(溶于甲醇，液體試管中反應(yīng))，未見(jiàn)紫色反應(yīng)，硅膠板分析亦未見(jiàn)利福霉素SV的Rf值變化。萘安莎類抗生素的早期鑒別尚待進(jìn)一步研究。    致謝：感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生

22、物技術(shù)研究所化學(xué)合成室李卓榮研究員、王玉成研究員對(duì)本文部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與解釋?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Stead P, Latif S, Blackaby A P, et al. Discovery of novel ansamycins possessing potent inhibitory activity in a cell?based oncostatin M signalling assay J. J Antibiot (Tokyo),2000,53(7):657663.2 Hosokawa N, Naganawa H, Hamada M, et al. New triene?ansamycins, thiazinotrienomycins F and G and a diene?ansamycin, benzoxazomycin J. J Antibiot (Tokyo),2000,53(9):886894.3 Hosokawa N, Naganawa H, Inuma H, et al. Thiazinotrienomycins, new ansamycin group antibiotics J. J Antibiot (Tokyo),1995,48