分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)2重組質(zhì)粒的提取及鑒定ppt課件

1、1實(shí)驗(yàn)二重組DNA的提取及酶切鑒定復(fù)旦大學(xué)根底醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心復(fù)旦大學(xué)根底醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心邵紅霞邵紅 2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆找韵路椒ê图夹g(shù)：掌握以下方法和技術(shù)： 1. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量快速制備的小量快速制備 2. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性?xún)?nèi)切酶酶切的限制性?xún)?nèi)切酶酶切 3. DNA的瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖凝膠電泳3二、實(shí)驗(yàn)原理 分別質(zhì)粒分別質(zhì)粒DNA有三個(gè)步驟：有三個(gè)步驟：1. 培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增培育細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增2. 搜集和裂解細(xì)菌本實(shí)驗(yàn)：搜集和裂解細(xì)菌本實(shí)驗(yàn)：SDS裂解裂解3. 分別和純化質(zhì)粒分別和純化質(zhì)粒DNA本實(shí)驗(yàn)：堿變

2、性本實(shí)驗(yàn)：堿變性法法1. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量快速制備的小量快速制備4堿變性法抽提質(zhì)粒堿變性法抽提質(zhì)粒DNASolution IIpH12.6Solution IIIpH4.8離心后去向離心后去向染色體染色體DNA氫鍵斷裂，雙氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)螺旋解開(kāi)不能復(fù)性不能復(fù)性沉淀中沉淀中質(zhì)粒質(zhì)粒DNA氫鍵部分?jǐn)嗔?，氫鍵部分?jǐn)嗔眩琧ccDNA互補(bǔ)鏈互補(bǔ)鏈不完全分離不完全分離復(fù)性復(fù)性上清中上清中5硅基質(zhì)資料硅基質(zhì)資料(樹(shù)脂與樹(shù)脂與DNA雙鏈相互作用的原理雙鏈相互作用的原理 DNA分子中的磷酸二酯鍵骨架在鹽溶液的作用下脫水，使分子中的磷酸二酯鍵骨架在鹽溶液的作用下脫水，使得暴露的磷酸基團(tuán)吸附硅膠。雙鏈得暴

3、露的磷酸基團(tuán)吸附硅膠。雙鏈DNA分子一旦被硅膠吸分子一旦被硅膠吸附，普通的洗液不能將其洗脫下來(lái)，只需水溶性的緩沖液，附，普通的洗液不能將其洗脫下來(lái)，只需水溶性的緩沖液，如如TE或水重新水化后，或水重新水化后，DNA才干從層析柱上定量回收。才干從層析柱上定量回收。6 2. 質(zhì)粒DNA的限制性?xún)?nèi)切酶酶切BamH I + Xba I雙酶切酶切完雙酶切酶切完全時(shí)全時(shí)瓊脂糖凝膠電泳凝膠中瓊脂糖凝膠電泳凝膠中2條區(qū)帶條區(qū)帶3.5kb pSV2載體片段載體片段4.8kb c-myc 目的基因片段目的基因片段pSV-c-mycBamH IXba Ic-myc基因片段基因片段4.8 kbpSV2載體片段載體片段

4、3.5kb7瓊脂糖瓊脂糖海藻中提取的線狀高聚物海藻中提取的線狀高聚物 加熱融化成清澈、透明的溶液加熱融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝膠凝固后成凝膠3. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳89DNA在凝膠中的遷移率的影響要素 DNA分子的大小分子的大小 瓊脂糖的濃度瓊脂糖的濃度 DNA的構(gòu)象的構(gòu)象 所加電壓所加電壓 嵌入染料的存在嵌入染料的存在 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度1011不同含量規(guī)范的瓊脂糖凝膠的分別范圍不同含量規(guī)范的瓊脂糖凝膠的分別范圍瓊脂糖凝膠濃度線狀瓊脂糖凝膠濃度線狀 DNA分子分別范圍分子分別范圍 %，m/V kb 0.3 560 0.5 130 0.6

5、 120 0.7 0.812 1.0 0.510 1.2 0.46 1.5 0.24 2.0 0.1312 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的的3種構(gòu)象種構(gòu)象瓊脂糖凝膠電泳凝膠中瓊脂糖凝膠電泳凝膠中1、2、3條帶都有能夠條帶都有能夠共價(jià)閉合環(huán)形共價(jià)閉合環(huán)形DNA開(kāi)環(huán)開(kāi)環(huán)DNA線性線性DNA存在復(fù)制中間體能夠存在復(fù)制中間體能夠13DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液141%瓊脂糖凝膠電泳中：瓊脂糖凝膠電泳中：溴酚藍(lán)遷移速率約與溴酚藍(lán)遷移速率約與300bp的線狀雙鏈的線狀雙鏈DNA一樣；一樣；二甲苯氰二甲苯氰FF約與長(zhǎng)約與長(zhǎng)4000bp的的DNA一樣一樣添加樣品密度，以確保添加樣品密度，以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔里均勻進(jìn)入樣

6、品孔里使樣品呈現(xiàn)顏色使樣品呈現(xiàn)顏色在電場(chǎng)中可預(yù)知速率向陽(yáng)極涌動(dòng)的染料在電場(chǎng)中可預(yù)知速率向陽(yáng)極涌動(dòng)的染料15三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)講義16四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)講義詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)講義1. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的小量快速制備的小量快速制備AXYGEN AxyPrep質(zhì)粒質(zhì)粒DNA小量制備試劑小量制備試劑盒本卷須知：盒本卷須知： 1. 初次運(yùn)用前，將初次運(yùn)用前，將RNaseA全部參與全部參與Buffer S1中，中，4 儲(chǔ)存儲(chǔ)存 2.初次運(yùn)用前，初次運(yùn)用前，Buffer W2 concentrate 中參中參與指定體積的無(wú)水乙醇與指定體積的無(wú)水乙醇 3. 運(yùn)用前檢查運(yùn)用前檢查Buffer S2能否

7、出現(xiàn)沉淀，假能否出現(xiàn)沉淀，假設(shè)有應(yīng)在設(shè)有應(yīng)在37加熱溶解并冷卻至室溫運(yùn)用加熱溶解并冷卻至室溫運(yùn)用 4. 自行預(yù)備無(wú)核酸和核酸酶污染的自行預(yù)備無(wú)核酸和核酸酶污染的tip頭和頭和離心管離心管 5. Buffer S2運(yùn)用后立刻蓋緊瓶蓋，以免空運(yùn)用后立刻蓋緊瓶蓋，以免空氣中的氣中的CO2中和中和Buffer S2中的中的NaOH，降，降低溶菌效率低溶菌效率17將細(xì)菌培育物全部倒入將細(xì)菌培育物全部倒入15ml離心管，離心管，4500rpm，5min加加250 l Buffer S1，吹打混勻也可，吹打混勻也可Vortex以充分懸浮細(xì)菌，轉(zhuǎn)入以充分懸浮細(xì)菌，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管離心管加加250 l Bu

8、ffer S2，上下顛倒，溫暖混勻，上下顛倒，溫暖混勻46次使菌體裂解次使菌體裂解加加350 l Buffer S3，上下顛倒，溫暖混勻，上下顛倒，溫暖混勻68次，次，12000g 離心離心10min汲取上清至已置于汲取上清至已置于 2ml 離心管的制備管中，離心管的制備管中，12000g離心離心1min，棄濾液，棄濾液同上，在制備管中加同上，在制備管中加500 l Buffer W1， 12000g離心離心1min ，棄濾液，棄濾液在制備管中加在制備管中加700 l Buffer W2， 12000g 離心離心1min ，棄，棄濾液，反復(fù)以濾液，反復(fù)以Buffer W2洗滌離心一次，再空離心

9、洗滌離心一次，再空離心1次次將制備管移入新的將制備管移入新的1.5ml離心管，在膜中央加離心管，在膜中央加60 l Eluent或去或去離子水，室溫靜置離子水，室溫靜置1min， 12000g離心離心1min，即為質(zhì)粒，即為質(zhì)粒DNA。防止猛烈搖擺，此步驟不宜超越防止猛烈搖擺，此步驟不宜超越5min防止猛烈搖擺防止猛烈搖擺Eluent液液65度溫育可提高洗脫效率度溫育可提高洗脫效率請(qǐng)堅(jiān)持同步！請(qǐng)堅(jiān)持同步！離心機(jī)配平離心機(jī)配平棄上清，瀝干，留意細(xì)菌沉淀別倒掉了！棄上清，瀝干，留意細(xì)菌沉淀別倒掉了！182. 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的限制性?xún)?nèi)切酶的雙酶切的限制性?xún)?nèi)切酶的雙酶切Buffer 4 2 lBamH

10、(20U/ l) 1 lXba(20 U/ l) 1 ldd H2O 10l質(zhì)粒質(zhì)粒DNA 6l 20 l混勻后短暫離心，混勻后短暫離心，37 水浴水浴1小時(shí)小時(shí)留意：留意：加樣順序加樣順序保證每樣試劑參與反響體系保證每樣試劑參與反響體系乙酰化乙酰化BSA可不加可不加加樣完成后需混勻，短暫離心加樣完成后需混勻，短暫離心反響終了后，上樣電泳前需短暫反響終了后，上樣電泳前需短暫離心，再加凝膠加樣緩沖液離心，再加凝膠加樣緩沖液及時(shí)將酶放回及時(shí)將酶放回-20 冰箱以保證酶冰箱以保證酶的活力的活力19預(yù)備好制膠器，插好梳子預(yù)備好制膠器，插好梳子并保證梳子距底部并保證梳子距底部0.5mm-1.2mm灌膠事

11、先加灌膠事先加GelRed留留意趕氣泡意趕氣泡待凝待凝預(yù)備好凝膠，加熱熔解預(yù)備好凝膠，加熱熔解20本卷須知：本卷須知：標(biāo)液面高度以察看水分能否蒸發(fā)過(guò)標(biāo)液面高度以察看水分能否蒸發(fā)過(guò)多，假設(shè)溶解后水分蒸發(fā)過(guò)多，多，假設(shè)溶解后水分蒸發(fā)過(guò)多，補(bǔ)水補(bǔ)水2. 三角燒瓶上覆打過(guò)洞的保鮮膜三角燒瓶上覆打過(guò)洞的保鮮膜防水蒸發(fā)防水蒸發(fā)防爆沸和燙傷帶手套防爆沸和燙傷帶手套加加6l GelRed后立刻灌膠戴手套后立刻灌膠戴手套稱(chēng)量稱(chēng)量agarose參與參與TAE 60ml，勿晃，勿晃微波爐溶膠微波爐溶膠留意先做好制膠預(yù)備！留意先做好制膠預(yù)備！1%agarose凝膠1%agarose凝膠21在電泳槽內(nèi)加電泳緩沖液在電泳

12、槽內(nèi)加電泳緩沖液拔去加樣梳，將制好的凝拔去加樣梳，將制好的凝膠連同內(nèi)架放入電泳槽內(nèi)，膠連同內(nèi)架放入電泳槽內(nèi)，保證液面高于凝膠面保證液面高于凝膠面參與參與6 凝膠加樣緩沖液凝膠加樣緩沖液和和DNA1:5比例混合比例混合依次加樣，并加好依次加樣，并加好Marker連通電源，連通電源，80V電泳至溴電泳至溴酚藍(lán)帶到達(dá)凝膠的酚藍(lán)帶到達(dá)凝膠的1/2處處結(jié)果察看和記錄結(jié)果察看和記錄DNA從陰極向陽(yáng)極遷移從陰極向陽(yáng)極遷移EBr從陽(yáng)極向陰極遷移從陽(yáng)極向陰極遷移加樣后不能挪動(dòng)電泳槽！加樣后不能挪動(dòng)電泳槽！22凝膠成像及分析系統(tǒng)凝膠成像及分析系統(tǒng)233. DNA的的1%瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳制膠：制膠：1%

13、 agarose 1% agarose ，防過(guò)熱暴沸，防過(guò)熱暴沸上樣預(yù)備上樣預(yù)備 1 1份凝膠加樣緩沖液加份凝膠加樣緩沖液加5 5份份DNADNA上樣和電泳上樣和電泳: : 每組上樣每組上樣2 2個(gè)個(gè) 未酶解質(zhì)粒和雙酶切產(chǎn)物未酶解質(zhì)粒和雙酶切產(chǎn)物 未酶解質(zhì)粒未酶解質(zhì)粒10 l +2 l10 l +2 l凝膠加樣緩沖液凝膠加樣緩沖液 雙酶切產(chǎn)物雙酶切產(chǎn)物20 l +4 l20 l +4 l凝膠加樣緩沖液凝膠加樣緩沖液 Marker5l, Marker5l, 放中間，放中間，2 2組組1 1塊膠塊膠 各組先做好預(yù)備，兩組一致集中上樣后電泳各組先做好預(yù)備，兩組一致集中上樣后電泳 電泳槽和電泳儀不可挪

14、動(dòng)電泳槽和電泳儀不可挪動(dòng)24 未酶切酶切未酶切酶切Marker10 l+2 l 20 l +4 l10 l+2 l 20 l +4 l5 l4. 結(jié)果察看和記錄結(jié)果察看和記錄80100V電泳，直到溴酚藍(lán)帶泳動(dòng)到凝膠的電泳，直到溴酚藍(lán)帶泳動(dòng)到凝膠的1/2至至2/3處處停頓。停頓。紫外燈下察看，拍照記錄。紫外燈下察看，拍照記錄。上樣圖示：上樣圖示：25預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果未酶切質(zhì)粒對(duì)照組雙酶切實(shí)驗(yàn)組雙酶切實(shí)驗(yàn)組雙酶切對(duì)照組雙酶切未酶切質(zhì)粒Marker26未酶切質(zhì)粒對(duì)照組雙酶切實(shí)驗(yàn)組雙酶切DNA/Hind Marker-23130-9416-6557-4361-2027-23221%agarose凝膠電

15、泳27發(fā)散性思索：發(fā)散性思索：為何細(xì)菌平板上的長(zhǎng)出的細(xì)菌集合是單克隆一個(gè)細(xì)菌來(lái)為何細(xì)菌平板上的長(zhǎng)出的細(xì)菌集合是單克隆一個(gè)細(xì)菌來(lái)源的？請(qǐng)例舉能夠的解釋來(lái)支持或反對(duì)這一說(shuō)法。源的？請(qǐng)例舉能夠的解釋來(lái)支持或反對(duì)這一說(shuō)法。為何線性的質(zhì)粒不易轉(zhuǎn)入細(xì)菌內(nèi)，如何從機(jī)理上解釋?zhuān)瑥臑楹尉€性的質(zhì)粒不易轉(zhuǎn)入細(xì)菌內(nèi)，如何從機(jī)理上解釋?zhuān)瑥膶?shí)驗(yàn)中證明？銜接時(shí)能否會(huì)出現(xiàn)多聚體？實(shí)驗(yàn)中證明？銜接時(shí)能否會(huì)出現(xiàn)多聚體？思索與疑問(wèn)：思索與疑問(wèn)：做感受態(tài)時(shí)，為何要在冰浴下進(jìn)展？能否還有其他能夠緣由做感受態(tài)時(shí)，為何要在冰浴下進(jìn)展？能否還有其他能夠緣由 為了讓細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，利于為了讓細(xì)胞膜流動(dòng)性降低，利于DNADNA的結(jié)合，同時(shí)使細(xì)胞暫停生長(zhǎng)，的結(jié)合，同時(shí)使細(xì)胞暫停生長(zhǎng)，維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高活性維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高活性 全程在冰浴下進(jìn)展，反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞破裂全程在冰浴下進(jìn)展，反復(fù)凍融會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞破裂2. 2. 為何細(xì)菌平板倒過(guò)來(lái)生長(zhǎng)更好？能否還有其他能夠緣由為何細(xì)菌平板倒過(guò)來(lái)生長(zhǎng)更好？能否還有其他能夠緣由 微生物培育時(shí)普通培育基中的水分含量較高，且培育溫度普通較高，微生物培育時(shí)普通培育基中的水分含量較高，且培育溫度普通較高，假設(shè)不將培育皿翻轉(zhuǎn)，培育基中的水分會(huì)揮發(fā)出來(lái)，呵斥培育基中的水假設(shè)不將培育皿翻轉(zhuǎn)，培育基